制備SDS-PAGE 凝膠

(1) 將灌膠玻璃板洗凈，晾干固定，確定灌制分離膠液面標志線（距樣品梳子底部約0.5-1.0cm 處）。ELISA試劑盒

(2) 配制10%分離膠8ml，快速灌入凝膠玻璃槽中，使其液面至標志線位置（避免產生氣泡）。

(3) 立即用去離子水覆蓋膠面（隔絕空氣，有助于凝膠聚合），室溫放置約40min至分離膠凝固。

(4) 配制5%濃縮膠4ml。

(5) 倒掉去離子水覆蓋液，并用吸水紙吸掉殘留的液體。將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%濃縮膠液（注意避免產生氣泡），插入樣品梳，室溫凝膠約40 分鐘。

(6) 輕輕拔去梳子，將玻璃夾板“凹”面貼緊電泳槽，兩側用夾子很好的固定在電泳槽上。

樣品變性及電泳

(1) 由-80℃冰箱取出提取的組織總蛋白樣品，立即插入冰中（減少蛋白降解）待其融化。

(2) 根據蛋白定量結果，加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液, 輕輕混合，95℃變性10分鐘，立即插入冰中待用。

(3) 將樣品輕輕加至凝膠孔中，電泳儀設置成穩壓狀態，接通電源，將電壓調至80V 使樣品通過濃縮膠與分離膠（電壓約8v/cm）。電泳使染料至分離膠適當位置，結束電泳。

3.4  凝膠轉膜及其檢測

   凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至固相支持物上，然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。用于Western 印跡法的固相支持物有多種，本實驗采用PVDF膜作為固相支持物。本實驗采用濕轉的轉膜方式。

(1) PVDF膜的預處理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、電轉液依次漂洗2min×2次，置于電轉液中備用；

(2) 剪裁與膠同樣大小的6 層濾紙，用轉移緩沖液浸泡后待用。

(3) 取下電泳板，將其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夾板中的墊片及去掉上層玻璃板，切除多余凝膠，將含樣品膠用電轉液漂洗一次。ELISA試劑盒

(4) 將樣品膠與膜裝入標有正、負極的轉膜夾板中：由陰極側開始，依次為海綿墊片→3 層濾紙→樣品膠→PVDF膜→三層濾紙（注意：排除氣泡）→海綿墊片，扣緊轉膜夾板，放入含有轉膜緩沖液的轉移電泳槽中。

(5) 正確連接轉移電泳連線，保證電荷由負極向正極流動。接通電源，恒壓狀態下，65v轉膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中進行）。

(6) 封閉：小心取出轉移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態下封閉1h。

(7) 一抗反應：將一抗用封閉液稀釋1000倍；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應過一個晚上。

(8) 洗膜：將反應膜放入平皿中，用1× TBST 洗滌三次，（室溫下緩慢搖動洗滌）每次10 分鐘，洗凈未結合的一抗。

(9) 二抗反應：將二抗用1×TBST 稀釋3000 倍；將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中（室溫、避光緩慢搖動）作用60 分鐘。

(10) 洗膜：用1×TBST 洗膜，方法同(8)，洗去游離二抗。

(11) 曝光及洗片：

①按1：1（v/v）混合ECL 試劑盒中兩種液體。

②將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用4分鐘。抖掉膜上液體，將其放入鋪有保鮮膜的曝光盒中，再將保鮮膜折疊，以包裹住PVDF膜。

(12) 曝光完成后將膜用PBST洗10min，用膜再生液洗滌30min，再用PBST洗3×10min，將膜封閉后再加一抗進行下一個抗體的檢測。ELISA試劑盒