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冷凍組織切片的制作

來源:上海北諾生物科技有限公司   2015年07月08日 14:40  

實驗試劑


液氮,干冰,1%明膠,4%多聚甲醛,PBS,含1%NP-40的PBS,3%BSA/PBS稀釋抗體,辣根過氧化物酶標記的二抗,DAB/金屬鹽試劑,3%過氧化氫,0.3%(W/V)氯化鎳貯存液,Harris蘇木精,乙醇


錨點

實驗設備


載玻片,Whatman 1濾紙,低倍光學顯微鏡


錨點

實驗材料


未受損傷的組織


錨點

實驗步驟


1. 將未受損傷的組織切剖成小樣本,約lcmXIcmX0.4cm。

2. 將標本放在卡片的一端。標記該卡片,將帶有標本的一端浸入液氮中。60s后,取出標本并放在干冰上。修剪卡片,使其大小剛好比組織塊稍大些,轉入預冷的(-70℃)帶有標記的小瓶中。

3. 切片前,用1%明膠包被潔凈的載玻片。加熱至50℃使明膠溶于水中,冷卻,加入0.02%疊氮鈉。將玻片浸入明膠溶液中30s,取出,自然干燥。

4. 按照儀器使用說明書,用低溫恒溫器制備冷凍切片。通常切片厚度在5-10gm之間。用包被過的載玻片收集切片。

5. 讓切片自然干燥。浸入新鮮配制的4%多聚甲醛中2min。

6. 用PBS洗數次,放入含1%NP-40的PBS中5rain。用PBS洗數次。

7. 將帶有組織切片的載玻片放在濕盒中。加合適稀釋度的一抗,用含蛋白質的溶液如3%BSA/PBS稀釋抗體。

單克隆抗體選用雜交瘤細胞培養上清(特異性抗體濃度為20-50gg/m1)。小鼠腹水、純化的單克隆抗體和多克隆抗體,以及粗制的多克隆抗血清應該測試其稀釋度,以使特異性抗體的濃度在0.1~10ug/m1之間。如果特異性抗體的濃度是未知的,則制備并測試初始制品的不同稀釋度(1:10,1:100,1:1000和1:10 000)。

8. 將玻片置濕盒中于室溫下孵育至少60min。對于某些反應來說,孵育時間可延長至24h,以增加其敏感性。

9. 用PBS洗3次,每次5min以上。

10. 加辣根過氧化物酶標記的二抗(特異性針對一抗)。這些試劑可以購自不同的經銷商。如果二抗的確切用量是未知的,測試1:50—1:1000稀釋的二抗。用含蛋白質的PBS稀釋,如3%BSA/PBS。

11. 將樣本置濕盒中,于室溫下孵育30min。

12. 用PBS洗3次,每次5min以上。

13. 配制DAB/金屬鹽試劑。將6mg DAB溶于9ml 0.05mol/L Tris緩沖液(pH7.6)中。加lm[0.3%(W/V)氯化鎳貯存液(可用相同濃度的氯化鈷代替)。加0.1ml 3%過氧化氫。如果出現沉淀,用Whatman 1濾紙(或相似品)過濾。

14. 將上述溶液加到標本中。在低倍光學顯微鏡下觀察。當形成足夠的棕/黑色沉淀時,用水沖洗以終止反應。通常這一反應過程約需1-20min。

15. 加數滴Harris蘇木精。孵育約5min。時間長短取決于染色的強度。

16. 用水輕柔沖洗。

17. 通過各級乙醇使標本依次脫水。在75%乙醇中孵育兩次,每次3min,95%乙醇中2次,每次3min,100%乙醇中2次,每次3min。自然干燥。

18. 加一小滴DPX至標本上。小心在其上面放一蓋玻片(1) 避免產生氣泡。用紙巾去除多余的液體。DPX很快可以凝固,樣品便可觀察并照相。

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