關(guān)鍵詞:多肽合成|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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多肽合成|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成的化合物。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：
1） 去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護(hù)基團(tuán)。
2） 激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。
3） 洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA） 洗脫和脫保護(hù)。
試劑檢測(cè)：沒(méi)有選購(gòu)在線檢測(cè)附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測(cè)方法做基本的耦合效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
固相多肽合成中，主要是通過(guò)檢測(cè)樹(shù)脂上游離氨基來(lái)判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。
Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經(jīng)過(guò)茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過(guò)程，取少量樹(shù)脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹(shù)脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說(shuō)明連接*。
其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等.
氨基酸保護(hù)基 
20種常見(jiàn)氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌Ｒ?jiàn)的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，一般要求，這些保護(hù)基在合成過(guò)程中穩(wěn)定，無(wú)副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以*定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù)，因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。
多肽縮合試劑 
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來(lái)完成接肽反應(yīng)，zui早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對(duì)稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來(lái)的縮合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。 
液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因，無(wú)法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。 
合成多肽分析鑒定方法 
多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD），NMR，X-衍射等方法。 
純度分析 
多肽的純度分析，一般都采用HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動(dòng)相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度，5%B--65%B，時(shí)間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個(gè)改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫；另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。