線粒體前體蛋白信號序列的特點是：①多位于肽鏈的N端，由大約20個氨基酸構成；②沒有帶負電荷的氨基酸，形成一個兩性α螺旋，帶正電荷的氨基酸殘基和不帶電荷的疏水氨基酸殘基分別位于螺旋的兩側，現在認為這個螺旋與轉位因子的識別有關；③對所牽引的蛋白質沒有特異性要求，非線粒體蛋白連接上此類信號序列，也會被轉運到線粒體。此外有些信號序列位于蛋白質內部，完成轉運后不被切除，還有些信號序列位于前體蛋白C端，如線粒體的DNA解旋酶Hmil。

線粒體具有四個功能區隔，即外膜、內膜、膜間隙、基質。進入不同部位的蛋白具有不同的轉運途徑。

進入外膜的蛋白具有不被切除的N端信號序列，其后還有疏水性序列作為停止轉移序列，然后蛋白質被TOM復合體安裝到外膜上，如線粒體的各類孔蛋白。

進入基質蛋白質可以先通過TOM復合體進入膜間隙，然后通過TIM復合體進入基質。也可以通過線粒體內、外膜間的接觸點（鼠肝直徑1um線粒體上約115個接觸點），一步進入基質，在接觸點上TOM與TIM協同作用完成蛋白質向基質的輸入
。