關(guān)鍵詞:Western Blot wb免疫印跡檢測課題|實(shí)驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌Western Blot wb免疫印跡檢測課題|實(shí)驗技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*。
Western Blot wb免疫印跡檢測課題|實(shí)驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計經(jīng)驗及實(shí)驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗。另一方面，我們所有的實(shí)驗數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗報告重復(fù)我們的實(shí)驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗 體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋 白水平的表達(dá)。
1. 組織塊稱重 
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊 
3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3 ml RIPA），PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron進(jìn)一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃ 
4. 加入PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分鐘 
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘 
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存 
7. 進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度 
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液 
9. 沸水浴中3分鐘 
10. 上樣 
11. 電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA） 
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40分鐘） 
13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色 
14. Westernblot 試劑盒顯色 
15. 分析比較記錄 
western blot的實(shí)驗步驟及注意事項的資料 
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。 
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。 
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。 
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。 
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。 
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。 
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。 
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。 
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。 
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。 
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。 
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃） 
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。 
10． 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時。 
11． 按步驟9洗滌。 
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動。 
注意事項： 
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗中取膠和膜需帶手套。