關(guān)鍵詞:MiRNA定量PCR|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介:世界*品牌MiRNA定量PCR|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,質(zhì)量保證,*。
MiRNA定量PCR|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產(chǎn)品品牌: http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>實時熒光定量PCR
從1996年美國AppliedBiosystems公司推出實時熒光定量PCR技術(shù)以來,該技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用到各類RNA的研究中,成為研究RNA*的實驗手段之一。目前比較常用的方法有兩種:
(1)TaqMan熒光探針法:該方法在特異性探針的兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當(dāng)探針完整時,熒光基團發(fā)光被淬滅基團吸收;在PCR擴增過程中,探針被降解,熒光基團與淬滅基團分離,發(fā)出可被檢測到的熒光,以此來監(jiān)測整個PCR過程。
(2)SYBR熒光染料法:該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)光的特性,檢測PCR的全部進程,從而判定初始RNA的量。
常用的miRNA*鏈合成方法
成熟的miRNA大小只有22 nt左右,在用實時熒光定量PCR檢測miRNA時,難點在于如何識別如此小的miRNA并合成*鏈。目前常用的用于識別并合成miRNA*鏈的方法主要有頸環(huán)法和加尾法兩種。
由于成熟miRNA較小,無法用常規(guī)的方法直接進行反轉(zhuǎn)錄、PCR。所以上述兩種方法分別加PolyA尾及頸環(huán)結(jié)構(gòu)的方法,將miRNA配對的序列延長,然后進行正常的反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的PCR檢測。頸環(huán)法只針對成熟miRNA,特異性相對較高,但操作繁瑣,成本較高;加尾法可以檢測到成熟miRNA及pre-miRNA,特異性稍低,但操作及引物設(shè)計簡單。
近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)了越來越多的miRNA,其中有很多miRNA序列相近,有的僅僅只有一個堿基差異。這些不同的miRNA雖然序列相近,但是也有著不同的來源及功能。上述兩種方法雖然解決了miRNA的識別及后續(xù)PCR問題,但是無法分辨這些只有一個或者兩個堿基差異的miRNA。美國Signosis推出了一種新的miRNA識別方法,可以分辨僅有單個堿基差異的miRNA。
美國Signosis推出的新方法,使用多對寡核苷酸對目的miRNA進行識別,單個堿基差異就可以破壞寡核苷酸與靶標(biāo)序列的結(jié)合,從而分辨單個堿基差異的miRNA;同時該方法不用進行方轉(zhuǎn)錄,避免了反轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)錯配的可能;同時,這個新方法還引入了磁珠分離技術(shù),在進行PCR前,通過結(jié)合有鏈霉親和素的磁珠對特異性標(biāo)記有生物素的靶標(biāo)序列進行純化,大大提高了特異性。
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