一、芯片制備

基因芯片的制備主要有兩種基本方法，一是在片合成法，另一種方法是點(diǎn)樣法。在片合成法是基于組合化學(xué)的合成原理,它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。目前，已有多種模板技術(shù)用于基因芯片的在片合成,如光去保護(hù)并行合成法、光刻膠保護(hù)合成法、微流體模板固相合成技術(shù)、分子印章多次壓印原位合成的方法、噴印合成法。在片合成法可以發(fā)揮微細(xì)加工技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，很適合制作大規(guī)模DNA探針陣列芯片，實(shí)現(xiàn)高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。美國Affymetrix公司制備的基因芯片產(chǎn)品在1.28*1.28cm²表面上可包含300,000個(gè)20至25mer寡核苷酸探針，每個(gè)探針單元的大小為10um X 10um。其實(shí)驗(yàn)室芯片的陣列數(shù)已超過到1,000,000個(gè)探針。 

基因芯片點(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn),并通過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。這種方式較靈活，探針片段可來自多個(gè)途徑，除了可使用寡聚核苷酸探針，也可使用較長的基因片段以及核酸類似物探針（如PNA等）。探針制備方法可以用常規(guī)DNA探針合成方法、或PCR擴(kuò)增的cDNA、EST文庫等。固定的方式也多種多樣。點(diǎn)樣法的*性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和儀器或cDNA探針庫，探針的長度可以任意選擇，且固定方法也比較成熟，靈活性大適合于研究單位根據(jù)需要自行制備科研型基因芯片，制作點(diǎn)陣規(guī)模較小的商品基因芯片。 

二、靶基因樣品的制備

與普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一樣，靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和標(biāo)記。基因芯片包括大量探針分子，因此，靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對(duì)象(如mRNA 、DNA等)而決定。對(duì)于大多數(shù)基因來說，mRNA 的表達(dá)水平大致與其蛋白質(zhì)的水平相對(duì)應(yīng)，因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)對(duì)于了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)十分重要。用基因芯片可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量基因的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，其靶基因的制備一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

待測(cè)樣品的標(biāo)記，主要采用熒光分子。常規(guī)標(biāo)記的過程是通過在擴(kuò)增過程中加入含有熒光標(biāo)記的dNTP（至少一種為熒光標(biāo)記的），熒光標(biāo)記的單核苷酸分子，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進(jìn)行分子雜交。也可采用末端標(biāo)記法，直接在引物上標(biāo)記熒光。即在引物合成時(shí)通過應(yīng)用熒光標(biāo)記的dNTP制備熒光標(biāo)記引物，或通過標(biāo)記生物素，進(jìn)行熒光標(biāo)記。

對(duì)于陣列密度較小的基因芯片(經(jīng)常用膜片作為基底)可以用同位素檢測(cè)法，采用³²P標(biāo)記技術(shù)，這樣可以運(yùn)用現(xiàn)在普通使用的同位素顯影技術(shù)和儀器。但是，在使用同位素靶基因標(biāo)記法過程中，一些表達(dá)量高雜交信號(hào)強(qiáng)的點(diǎn)陣，容易在其周圍產(chǎn)生光暈，當(dāng)其周圍點(diǎn)陣的雜交信號(hào)較弱時(shí)，其雜交信號(hào)容易受到強(qiáng)雜交信號(hào)的掩蓋。 

三、靶基因的雜交及其信號(hào)的檢測(cè)

cDNA基因芯片與靶基因的雜交過程與一般常規(guī)的分子雜交過程基本相同。在基因芯片的雜交檢測(cè)中，為了更好的比較不同來源樣品的基因表達(dá)差異，或者為了提高基因芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和測(cè)量范圍，通常使用多色熒光技術(shù)。即把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長的的熒光探針來修飾，并同時(shí)使它們與基因芯片雜交。通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖，可以直接獲得不同樣品中基因表達(dá)的差異。

人們還發(fā)展了其它靈敏度高、特異性好的基因芯片雜交檢測(cè)方法。例如短序列偶聯(lián)法。該方法首先將非標(biāo)記的DNA靶序列與基因芯片上探針陣列進(jìn)行*雜交，若基因芯片上探針的固定端是5’端時(shí)，繼續(xù)以靶基因?yàn)槟０澹梢栽诒┞队谌芤褐械?’-OH上用DNA聚合酶合成上新的帶有熒光標(biāo)記的堿基（ddNTPs）。通過檢測(cè)ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 

美國Nanogen公司提出了一種通過交變電場加速基因芯片的雜交速度的主動(dòng)式基因芯片。他們利用核酸分子所帶的負(fù)電性質(zhì)，通過快速反轉(zhuǎn)電場的極性，使靶基因與探針間產(chǎn)生快速結(jié)合和分離。通過控制電場的大小，使得*匹配雜交的核酸分子保留在陣列表面，而非特異性結(jié)合的DNA在電場的作用下與探針分離。這種芯片的分子雜交速度可縮短至1分鐘以下甚至數(shù)秒（cheng et al，1998），因此有較廣闊的應(yīng)用前景。