關(guān)鍵詞:微生物菌群多樣性分析(DGGE)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
DGGE是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。具體而言，就是將特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨著電泳的進(jìn)行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當(dāng)它到達(dá)其變性要求的zui低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態(tài)，這就導(dǎo)致其遷移速率變慢，由于這種變性具有序列特異性，因此DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開，它是一種很有用分子標(biāo)記方法。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物多樣性調(diào)查、親緣關(guān)系鑒定、基因突變檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。
主要步驟
DGGE對(duì)微生態(tài)的分析一般包括三個(gè)步驟:核酸提取，16SrRNA序列的PCR擴(kuò)增以及DGGE指紋圖譜分析。
1、將海綿墊固定在制膠架上，把類似‘三明治’結(jié)構(gòu)的制膠板系統(tǒng)垂直放在海綿上方，用分布在制膠架兩側(cè)的偏心輪固定好制膠板系統(tǒng)，注意一定是短玻璃的一面正對(duì)著自己。
2、共有三根聚乙烯細(xì)管，其中兩根較長(zhǎng)的為15.5cm，短的那根長(zhǎng)9cm。將短的那根與Y形管相連，兩根長(zhǎng)的則與小套管相連，并連在3、在兩個(gè)注射器上分別標(biāo)記‘高濃度’與‘低濃度’，并安裝上相關(guān)的配件，調(diào)整梯度傳送系統(tǒng)的刻度到適當(dāng)?shù)奈恢谩?br>4、反時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)凸輪到起始位置。為設(shè)置理想的傳送體積，旋松體積調(diào)整旋紐。將體積設(shè)置顯示裝置固定在注射器上并調(diào)整到目標(biāo)體積設(shè)置，旋緊體積調(diào)整旋紐。例如16*16cmgels(1mmthick)：設(shè)體積調(diào)整裝置到5、配制兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液到兩個(gè)離心管中。
6、每管加入80μl10%APS，迅速蓋上并旋緊帽后上下顛倒數(shù)次混勻。用連有聚乙烯管標(biāo)有‘高濃度’的注射器吸取所有高濃度的膠，對(duì)于低濃度的膠操作同上。
7、通過推動(dòng)注射器推動(dòng)桿小心趕走氣泡并輕柔地晃動(dòng)注射器，推動(dòng)溶液到聚丙烯管的末端。注意不要將膠液推出管外，因?yàn)檫@樣會(huì)造成溶液的損失，導(dǎo)致zui后凝膠體積不夠。
8、分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確一側(cè)固定好，注意這里一定要把位置放正確!再將注射器的聚丙烯管同9、輕柔并穩(wěn)定地旋轉(zhuǎn)凸輪來傳送溶液，在這個(gè)步驟中zui關(guān)鍵的是要保持恒定勻速且緩慢地推動(dòng)凸輪，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝膠板中。
10、小心插入梳子，讓凝膠聚合大約一個(gè)小時(shí)。并把電泳控制裝置打開，預(yù)熱電泳緩沖液到60℃。
11、迅速清洗用完的設(shè)備。
12、聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內(nèi)，清洗點(diǎn)樣孔，蓋上溫度控制裝置使溫度上升到60℃。
13、用注射針點(diǎn)樣（預(yù)先準(zhǔn)備好的活性污泥擴(kuò)增產(chǎn)物，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化）。
14、電泳（200V，5h）。
15、電泳完畢后，先撥開一塊玻璃板，然后將膠放入盤中。用去離子水沖洗，使膠和玻璃板脫離。
16、倒掉去離子水，加入固定液（10%乙醇,0.5%冰醋酸）中，放置17、倒掉固定液，用去離子水沖洗兩次，倒掉后加入0.2%AgNO3,用之前加入。
18、倒掉銀染液，用去離子水沖洗兩次，倒掉后加入1.5%NaOH,0.5%甲醛）顯色。
19、待條帶出現(xiàn)后拍照。