關鍵詞:探針合成技術服務|實驗技術服務
簡介:世界*品牌探針合成技術服務|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
探針合成技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
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測序實驗流程:
1、 合成cDNA步驟
(1) 加入從卵巢癌細胞或組織中提取的總RNA ≥ 5ug。
(2) 加入 Nuclease-free 水 75 ul
(3) 加入 5x iScript Reaction Mix,按20 ul/ 100ul 比例加入。
(4) 加入 iScript RT,5 ul.
(5) 在pcr儀上,按以下步驟進行加熱:
5 minutes at 25°C;30 minutes at 42°C;5 minutes at 85°C。
儲存在 –20C冰箱。
2、 擴增ERCC2目的片段
(1) 訂購ERCC2引物,序列如下:
F:5'-CCGctcgagGCTCCTGGTCTACTTCCCGTACG-3'
R:5'-ATTTgcggccGCACGCAGCCGCCACTTCACGTAC-3'
(2) 準備反應液:
按以下試劑比例進行反應MIX的配置:
10x reaction buffer 5 ul (1x)
dNTPs (stock 10 mM) 1.0 ul (200uM
Forward primer (250uM) 1.0 ul (0.2 uM)
Reverse primer (250 uM) 1.0 ul ( 0.2 uM)
cDNA template 1 ul (1 ug)
Taq PCR Polymerase enzyme 0.5 ul
ddH20 up to 50 ul
Total 50 ul
(3) PCR 反應過程
1) 準備PCR儀,并檢查是否可用。
2) 打開PCR儀頂蓋,將96PCR板放置在加熱模塊上蓋緊頂蓋;
3) 選擇程序如下:
1cycle:94’C,3 min
35 cycles: 94’C,30s;62’C,1 min;72’C,1.5 min
1cycle:72’C,7 min;4’C forever
(4) 配制瓊脂糖凝膠:
1) 取出干燥的鋪膠板。
2) 稱取2.5g 的瓊脂糖,放入250ml 的容量瓶中,用量筒量取250ml 的1x TAE 加入容量瓶中,輕輕搖晃2-3 下。
3) 將盛有TAE 和瓊脂糖的容量瓶放入微波爐中,高火加熱4min。
4) 小心取出,室溫冷卻5-10min,稍微搖晃混勻,待溶液溫度冷卻到60℃(不燙手為宜),混勻。
5) 將瓊脂糖溶液倒入事先準備膠槽中,將梳子放置在膠槽上,室溫避光放置30min 左右。
6) 待凝膠干燥后備用。
(5) 瓊脂糖凝膠電泳:
1) 準備PCR產物。
2) 取出酶標板,吸取1ul 6x loading buffer,加入酶標板孔底,加入5ul PCR 產物與loading buffer混勻。
3) 將8道移液器調至6ul,吸取樣本點樣電泳,原則是從右向左,從下向上,140v,電泳20min 左右。
4) 將電源斷開,取出瓊脂糖凝膠,放入盛有EB的容器中,泡10min。
5) 將浸泡過的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統照相,保存膠圖。
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