關(guān)鍵詞:實時熒光定量PCR|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介:世界*品牌實時熒光定量PCR|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,質(zhì)量保證,*。
實時熒光定量PCR|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產(chǎn)品品牌: http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA質(zhì)量檢測
1)紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 ?g/ml。具體計算如下:
RNA溶于40 ?l DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495?l的TE中,測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l
取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 ?l,剩余RNA總量為:
35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制
1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
②準(zhǔn)備RNA樣品
取3?gRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。
④紫外透射光下觀察并拍照
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