（一）雙縮脲測定法

1．原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強(qiáng)，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測出毫克水平。

2．試劑配制

硫酸銅（CuSO₄ ^.5H₂O） 1.50g

酒石酸鉀鈉 5.00g

H₂O 500.0ml

10%氫氧化鈉（不含硫酸鈉）300ml

H₂O 加至 1 000ml

此溶液可長期保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。

3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時(shí)須首先采用凱氏定氮法測定牛血清白蛋白制品中實(shí)際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1%的濃度。

⑵ 將1%的牛血清白蛋白按表8-1進(jìn)行稀釋：

表8-1 牛血清白蛋白稀釋方法表

注：1%牛血清白蛋白，經(jīng)凱氏定氮測定含純蛋白為80%。

⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測3次，求其平均值。

⑷ 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4．樣品測定

⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1-10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。

⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。

⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對照。

⑷ 測OD₅₄₀ 值。

⑸ 根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。

注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時(shí)間均有差異，一旦標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后，樣品的測定則必須與標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的條件一致，否則結(jié)果有差異。

（二）紫外光譜吸收法

1．原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光區(qū)的吸收特點(diǎn)而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測到微克水平，操作簡單，不需要加各種試劑，測完后，樣品可回收。

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。

⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對照。

⑶ 測各管OD₂₈₀ 值。

⑷ 以O(shè)D₂₈₀ 值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。