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PCR產物的TA克隆

來源:上海北諾生物科技有限公司   2015年04月01日 15:27  

 

實驗原理


1. DNA段回收方法:DN片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中,通上一定電壓進行電泳,不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DN片段的凝膠,用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
2. 利用Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A,而T載體是一種帶有3’T突出端的載體,在連接酶作用下,可以把PCR產物插入到質粒載體的多克隆位點,可用于PCR產物的克隆和測序。


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實驗試劑


1. pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)
2. TAE電泳緩沖液
3. 瓊脂糖(Agarose)
4. 6×電泳加樣緩沖液:0.25%溴粉藍,40%(w/v) 蔗糖水溶液,貯存于 4℃。
5. 溴化乙錠(EB)溶液母液:配制成10mg/mL,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。
6. 70%乙醇
7. 膠回收試劑盒(Omega公司)


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實驗設備


1. 水平式電泳裝置

2. 電泳儀

3. 臺式高速離心機

4. 恒溫水浴鍋

5. 微量移液槍

6. 微波爐或電爐

7. 紫外透射儀

8. 凝膠成像系統或其它照相設備


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實驗步驟


1. 膠回收試劑盒回收PCR產物(以Omega公司 Gel Extraction Kit為例)

   1) 當目的片段DNA*分離時,轉移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。
   2) 凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中,稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積(假設其密度為1g/ml)。加入等體積的Binding Buffer(XP2),于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠*融化,每2-3 min振蕩混合物。(在凝膠*溶解之后,注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話,DNA的產量將大大減少。如果是橙色或紅色,則要加入5μl 濃度為5 M,pH為5.2的醋酸鈉,以調低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。)
   3) 取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(已備好)。
   4) 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。
   5) 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul,一次只能轉移700ul至柱子中,余下的可繼續重復第5步至所有的溶液都經過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產量較大,則把樣品分別加到合適數目的柱子中。
   6) 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中,室溫下, 10,000 x g下離心1min。
   7) 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移700μl SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。(濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的,須將其拿出置于室溫下)。
   8) 重復用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
   9) 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質殘余的液體。
   10) 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上,加入15~30μl(具體取決于預期的終產物濃度)的Elution Buffer(或TE緩沖液)到柱基質上,室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。*次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA。如果再洗脫一次的話,可以把殘余的DNA洗脫出來,不過那樣的濃度就會較低。

2. 連接反應(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例)

   1) 在微量離心管中配制下列DNA溶液,全量為5 μl。
   pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
   Insert DNA 0.1 pmol~0.3 pmol
   dH2Oup to 5 μl
   2) 加入5 μl(等量)的 Solution I。
   3) 16℃反應30分鐘。(2 kbp以上長片段PCR產物進行DNA克隆時,連接反應時間請延長至數小時)。
   4) 全量(10 μl)加入至100 μl 感受態細胞中,冰中放置30分鐘。
   5) 42℃加熱45秒鐘后,再在冰中放置1分鐘。
   6) 加入890 μl LB培養基,37℃振蕩培養60分鐘。
   7) 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養,形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
   8) 挑選白色菌落,鑒定載體中插入片段的長度大小。


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注意事項


1. 使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復使用,其PH的升高會減少產量。
2. 不論采取何種方法回收DNA,在回收過程中,要盡量減少洗脫體積,以便提高收得率和濃度,以方便后續操作。
3. 從膠上回收DNA時,應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm),以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
4. 連接反應時間是與溫度密切相關,因為反應速度隨溫度的提高而加快。通常可采用16℃連接4小時為宜,如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率;在選擇反應的溫度與時間關系時,也要考慮在反應系統中其他因素的影響。
5. 連接反應的整個過程應注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染,為防止酶活性降低,取酶時應在冰上操作且動作迅速。
6. 連接反應應在25℃以下進行,溫度升高較難形成環狀DNA,影響連接效率。長片段PCR產物(2kb以上)進行連接時,連接反應時間應延長至數小時。
7. 進行克隆時,Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比一般為1:2~10。根據實驗情況選擇合適的摩爾數比。
8. 用的感受態細胞(轉化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。

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