實驗試劑

1. L-Leucine，ATP，DTT，焦磷酸鈉(tetrasodium pyrophosphate)和HA-Ultrogel購自美國Sigma公司。

2. [³²p]-焦磷酸鈉購自美國杜邦公司。

3. L-[^I4C]-亮氨酸和DEAE-Sepharose^TM Fast Flow購自英國Amersham公司。

4. 限制性內切酶和T4DNA連接酶購自立陶宛MBI Ferments公司。

5. 質粒pTrc-99B。

實驗材料

大腸桿菌LeuRS從高表達大腸桿菌菌株中純化得到

實驗步驟

1. 突變體LeuRS基因的構建

以構建的編碼大腸桿菌LeuRS的基因leuS作為模板，利用兩步PCR反應擴增得到六個LeuRS變種酶的基因序列。

一輪PCR反應的5’和3’引物：上下游引物分別具有NcoI和HindIII酶切位點，構建各突變所用的引物略。PCR反應產物經用NcoI和HindIII雙酶切后，嵌入表達載體pTrc-99B的NcoI和HindIII兩個酶切位點間的切口內。得到的LeuRS 6個變種酶基因的正確性用DNA測序證實。

2. LeuRS及其變種酶基因的表達和純化

將含有LeuRS及其六個變種酶LeuRS-E292K，LeuRS-E292F，LeuRS-E292S，LeuRS-E292D，LeuRS-E292Q，LeuRS-E292A的基因的重組質粒轉化到在大腸桿菌菌株TG1中，挑選含有正確質粒的轉化子至5 mL氨芐-LB液體培養基，37℃，300 rpm振蕩培養轉化子至對數生長期，用0. 5 mM IPTG誘導6小時，取出20ul培養液，加入等體積的SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸10分鐘，離心取上清液進行SDS-PAGE檢查轉化子中各變種酶基因的表達情況。將高表達轉化子5 mL菌液轉接至500 mL氨芐-LB液體培養基中37℃，300 rpm培養至對數生長期，用0. 5 mM IPTG誘導8小時，收集菌體。將濕菌體懸浮于20毫升0℃預冷的破菌緩沖液(50 mM磷酸鉀緩沖液，pH6.8，含10 mM β-琉基乙醇，2 mM PMSF，10%甘油)中，冰浴超聲波破菌。將破菌液于4℃，12,000g離心30分鐘后繼續經4℃，150,000g超離心1小時。取上清液經過DEAE-SepharoseTM Fast Flow和HA-Ultrogel兩步柱層析純化。在DEAE-Sephorose CL-6B fast flow純化中使用的線性洗脫梯度為pH6.8的磷酸鉀緩沖液50 mM-500 mM。在HA-Ultrogel純化中使用的線性洗脫梯度為pH 6.8的磷酸鉀緩沖液20 mM-300 mM。收集的含LeuRS以及變種酶的洗脫峰，用PEG 20000濃縮，對10 mM pH 6.8的磷酸鉀緩沖液透析。加入50%0℃預冷的甘油，保存于-20℃。

3. 蛋白質濃度測定

粗抽液蛋白質的濃度用Bradford方法測定。純化后的LeuRS以及變種酶的濃度可以通過以下公式計算得到：1 A₂₈₀=1.62 mg/ml。

4. 酶活力測定

氨基酸活化反應的條件如下：35ul反應液中含有100mM HEPES (pH7.8)，10mM KF，10 mM MgCl₂，4 mM ATP，2 mM [³²P] PPi和1 mM亮氨酸，在37℃保溫，用約4 nmol/L LeuRS起始反應，于不同時間，取出15ul反應液，加入200ul淬滅液中(3.5%高氯酸，2%活性炭和0.05 M焦磷酸鈉)停止反應，在淬滅液中再加入5毫升10 mM焦磷酸鈉溶液，用Whatman GF/C濾紙過濾以上溶液，收集吸附³²P-ATP的活性炭粉末，依次用10 mM焦磷酸鈉(2x5 ml)和95%乙醇(2x5ml)洗滌和抽干，烘干后，投入閃爍液，閃爍液為0.6%2-(4-叔丁基苯-5-(4-雙苯基)1,3,4二唑[溶劑為乙二醇甲醚/甲苯(體積比為6/4)]，計數活性炭粉末吸附的³²P-ATP的量。氨基酸活化反應活力的單位定義為在測定條件下，每分鐘催化1納摩爾PPi形成ATP所需要的酶量。氨基酞化反應的條件如下：35ul反應液中含有100 mM Tris-HCl (pH7.8)，30 mM KCl，12 mMMgCl₂，4 mM ATP，0.1 mM EDTA，0. 5 mM DTT，20uM tRNA^leu，0.1mMC亮氨酸在37℃保溫，用約5 nM LeuRS起始反應。不同時間取15ul反應液滴在Whatman 3#濾紙上((1.0cm×1.0cm)，放置5秒鐘后，將紙片投入5%三氯中(含有5 mM亮氨酸)，0℃浸泡10分鐘，換2次5%三氯溶液，再用95%乙醇浸泡兩次，烘干濾紙片。投入PPO/POPOP閃爍液((5 g PPO0.25 g POPOP溶解于1L甲苯)，液閃計數。氨基酞化反應活力單位定義為:在測定條件下，每分鐘催化產生1納摩爾亮氨酞-tRNA^leu所需的酶量。

5. CD光譜和熒光光譜的測定

測定CD光譜所使用的儀器為Jasco J-715型圓二色性儀。蛋白質樣品在10 mM磷酸鉀溶液((pH 6.8)中的濃度為0.2 mg/ml，測定溫度為室溫，所用比色杯的光徑為0.lcm。熒光光譜的測定在日本Hitachi F-4010熒光分光光度計上進行。測定發射光譜時，激發波長為295 nm，狹縫為3 nm，發射光譜掃描范圍為300-400 nm。熒光杯的光路長為1 cm。蛋白質樣品在10 mM磷酸鉀溶液(pH 6.8)中的濃度為0.1 mg/ml。