人工合成的磷酸萘酚鹽經堿性磷酸酶 水解后釋放出萘酚，后者立即與重氮鹽偶聯生成不溶性偶氮色素。

    1)孵育液配制

    萘酚AS(或萘酚AS-MX)                              10―25rug

    N，N―二甲基甲酰胺液                             0．5ml

    0．2mol／LTris鹽酸緩沖液(pH 8．2―9．2)          50ml

    堅牢藍B(或BB、RR，或堅牢紅TR、堅牢藍VRT)         50mg

    混合、攪拌及過濾，必要時可使用氫氧化鈉調整pH。

    2)操作程序：

    ①新鮮組織冰凍切片：

    ②人孵育液，37C(或室溫下)孵育5―60分鐘；

    ③雙蒸水洗3～5分鐘；

    ④4％甲醛，室溫下固定10～15分鐘；

    ⑤蒸餾水洗3～5分鐘；

    ⑥甘油明膠封固。

    3)結果與評價：采用不同的重氮鹽。酶的活性顯色也不同，用堅牢藍B(或BB、RR)酶活性呈藍紫色，用堅牢紅TR(或堅牢紫B)酶活性呈紅色。萘酚法有三個優點：

    ①反應產物溶解度小。局部比較明顯；

    ②萘酚化合物能較快地被水解，可縮短孵育時間；

    ③反應產物立即可見，并顯示出顏色。

    4)對照實驗：方法與鈣―鈷法相同。