牛血清在細胞培養中的作用及產生的常見問題

現代生物技術包括基因工程、細胞工程、酶工程和發酵工程，這些技術的發展幾乎都與細胞培養有密切的關系，特別是在生物醫藥領域，細胞培養更具有特殊的作用。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產過程中很多都是通過細胞培養來實現的，基因工程乙肝疫苗大多是以 CHO細胞作為載體；基因工程抗體藥物的制備也離不開細胞培養。細胞工程領域更離不開細胞培養技術，雜交瘤單克隆抗體的研究制備*是通過細胞培養來實現的，發酵工程和酶工程有的也與細胞培養密切相關。總之，細胞培養在整個生物技術產業的發展中起到了很關鍵的核心作用。細胞培養的發展，培養基的質量是關鍵，而培養基的構成中動物血清對細胞的生長繁殖起著重要作用。在動物血清中牛血清的應用又是zui廣泛的，所以牛血清的質量好壞直接影響生物制品的質量和安全性。

一、牛血清的主要成分

牛血清是一種成分復雜的混合物，其大部分成分已為人所知，但還有一部分仍不清楚，而且血清的組成及含量通常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而存在差異。牛血清主要成分有以下幾類：

1 、蛋白質類   包括白蛋白、球蛋白、α -巨球蛋白（抑制胰蛋白酶的作用）、胎球蛋白（促進細胞附著）、 轉鐵蛋白（能結合鐵離子，減少其毒性和被細胞利用）、纖維粘連素（促進細胞附著生長）等；

2 、多肽類    主要是一些促進細胞生長和分裂的生長因子，zui主要的生長因子是血小板生長因子，還有成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子等，雖然在血清中含量很少，但對細胞的生長和分裂也起著重要作用；

3 、激素類    激素對細胞的作用是多方面的。包括：

胰島素：促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細胞分裂有關；

類胰島素生長因子：能與細胞表達的胰島素受體結合，從而有胰島素同樣的作用：

促生長激素：促進細胞增殖的效應；

4 、其他成分    如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。在合成培養基中這些成分的作用并不明顯，與蛋白相結合的微量元素對細胞生長起促進作用。

二、牛血清在細胞培養基中的主要功能

牛血清是細胞培養中用量zui大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要的功能。

1 、提供能促使細胞指數生長的激素、基礎培養基中沒有或含量微小的營養物，以及某些低分子營養物質；

2 、提供結合蛋白，識別維生素、脂類、金屬離子，并與有毒金屬和熱源物質結合，起解毒作用；

3 、是細胞貼壁、鋪展生長所需因子的來源；

4 、起酸堿度緩沖液作用；

5 、提供蛋白酶抑制劑，細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受損傷。

三、牛血清的分類

根據牛出生時間和血清采制分離方法分為：

1 、胎牛血清：八月齡胎牛心臟穿刺取血；

2 、新生牛血清：出生 12-24小時新生牛靜脈采血；

新生牛血清：采血后靜置自然析出的血清；

標準新生牛血清：經離心分離的血清；

       普通新生牛血清：融血或微融血的血清；

3 、小牛血清：出生三月齡小牛動脈采血分離血清；

四、牛血清的質量要求

（一） WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求 :

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家，并應具備適當的監測系統。

2. 有些國家還要求牛血清來自沒有用過反芻動物蛋白飼料喂養的牛群。

3.要能證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5.無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無大腸桿菌噬菌體污染。

6.要求血清對細胞有良好的支持繁殖作用。

（二）我國在對牛血清的質量標準zui早在 2000年版《中國生物制品主要原輔材料質控標準》中提出。包括物理性狀、總蛋白，血紅蛋白、細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。 2005版藥典頒布之后，小牛血清質量標準被納入《中國藥典》 2005年版 第三部生物制品分冊。

（三）美國對牛血清的質量要求：

Gibco 和 hyclone等美國主要血清供應商的牛血清都已進入到我國市場，他們對血清質量標準有嚴格要求，從血清來源到產品質量都有明確規定。

1 、血清來源 ：可從世界各地收集胎牛血清，但必須符合其質量標準和美國農業部進口要求。

2 、血清的收集：必須符合工業生產的標準，低溫采集，一次分離，分離后立即混合凍存。

3 、血清的制備：超低 IgG胎牛血清、透析血清、 γ - 射線輻照；

4 、除菌過濾： 0.22 μ m 和 0.1 μ m 濾膜過濾；

5 、成品分裝：根據需要分裝成不同規格。

五、牛血清質量檢定指標

1 、化學檢定：包括滲透壓（ 240～ 340）、 pH（ 7.0～ 8.0）、總蛋白含量（ 3.5～ 5.0％）、血紅蛋白 （≤ 0.02％）

2 、微生物檢查：細菌和真菌 ——直接培養法、噬菌體 ——噬斑法和增殖法、支原體 ——培養法和

DNA 染色法 、牛病毒 ——細胞培養法。要求均為陰性。

3 、內毒素檢測 ——凝膠法和動態濁度法。要求內毒素含量≤ 10EU/ml

4 、促細胞生長測定（ SP2/0-Ag14標準規定）

      1 ）zui大增殖濃度≥ 1.0× 106個 /ml、倍增時間≤ 20小時  

         克隆率＝（陽性孔平均數 /培養孔總數）× 100％

      2 ）貼壁效率（ VERO細胞、二倍體細胞等）

        10 ％血清―― 50或 100個細胞 /孔

        貼壁效率（％）＝（每孔克隆平均數 /每孔存活的培養細胞平均數）× 100％

    相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率 /參考血清貼壁效率

以上項目檢定結果應符合 2005版《中國藥典》第三部的相關規定。血清廠家應在此基礎上結合疫苗病毒生產工藝建立企業內控檢定項目并建立相應的檢定方法，保證疫苗病毒生產的穩定性，提高疫苗制品的質量。  

六、牛血清的使用所產生的常見問題

（一）由于血清營養豐富，貯存條件特殊，因此在貯存和使用過程中容易產生以下問題：

1 、改變培養液的 pH值

牛血清的 pH理論值為 7.0～ 8.0，培養基在加入規定量的碳酸氫鈉后（即達到細胞生長所需要的滲透壓），再加入 10％的牛血清，一般會使培養液的 pH值發生改變。因此在使用過程中應注意 PH的變化，如有必要可用 1mol/LNaOH或 1mol/LHCl調 pH到所需值。

2 、由于血清的營養成分豐富，非常適合細菌、真菌和支原體等生長。國產血清大部分采用手工分裝，因此容易把微生物帶入而使得血清被污染。使用前如果沒有及時發現，將會把污染物帶入正在培養的細胞中，而使得細胞不能正常生長。

3 、血清在貯存解凍過程中會產生沉淀，這是由于血清中含有大量脂蛋白、纖維蛋白及多肽類物質，在 -15℃冷凍保存解凍后就會自然形成沉淀，隨著保存時間的延長，沉淀量會增加。因此在融化血清時一般應先在 4 ℃放置使之解凍，然后放在室溫使血清*融化，以避免沉淀的增加。添加血清時應避免把沉淀加入培養液，否則由于沉淀的存在會使得所培養的細胞產生大量黑點，或者細胞表面將會覆蓋一層油狀物質，影響細胞的正常生長。為減少血清的損失，可以把有沉淀的血清收集起來進行離心處理，將上清液加入培養液使用（一般不建議采用過濾的方法除去沉淀，因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾）。

（二）大規模細胞培養中牛血清對細胞及病毒滴度的影響

血清是一種成分復雜的混合物，不同批次血清對細胞生長的促進作用不同。大規模細胞培養中由血清引起的細胞生長狀態不佳及病毒滴度的影響表現在以下幾個方面：

1 、細胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；從同一細胞瓶中分出兩瓶細胞，用同一種培養液，分別加入 10％的對照血清和待檢血清，在相同條件下培養 72小時，會出現對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有 60～ 70％，這種血清就不適合用來大規模培養細胞。

2 、細胞傳代后形態不正常，細胞狀態發生變化 ；由于血清的質量問題，使原本狀態正常的細胞經傳代后形態會變差；比如：細胞瓶里會出現一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細胞表面形成一層油狀覆蓋物；細胞的輪廓變得模糊，細胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細胞向四周擴展生長。

    3 、細胞傳幾代后就出現脫壁現象，不能連續傳代 ；質量較差的血清缺乏某種細胞的貼壁因子，會使細胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細胞會從正常的貼壁狀態，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現象就是細胞表面不光滑，晃動細胞瓶會看到細胞表面有絮狀物隨培養液波動。隨著傳代次數增加，細胞萎縮的情況越來越嚴重，直到zui終*脫壁而死亡。

4 、細胞長的很好，致密的單層，狀態也很正常，但是接毒后細胞基本不發生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會把接進去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業造成的損失是相當大的，不產毒等于前面所做的那么多工作全部白費，浪費人力、物力，尤其是時間上的浪費，從培養細胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個月，一旦出現不產毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費掉了，這也是牛血清給疫苗企業造成的風險之一。

5 、細胞生長的狀態一般，產毒少，毒價低。這種情況比較常見，細胞是病毒的載體，由于血清質量不好，導致細胞生長狀態不好，病毒就無法進行正常的復制。并非所有病毒都不能復制，所以就造成疫苗的效價不夠，可能造成不合格產品。

（三）牛血清給生物制品帶來的問題

對于使用傳統培養基培養的大多數細胞來說，添加牛血清是*的。但是牛血清的使用也給細胞培養和生物制品的生產帶來很多問題，并成為生物制品生產水平達到*化和實現

經濟性目標的一大障礙。

1 、批間差異  

血清是一種成分復雜而且不確定的混合物，不同來源的血清成分存在很大的差異，因此支持細胞生長的效果也有較大差別。而每批血清的批量是有限的，所以換血清批號時要預先做大量的篩選實驗，以確定對細胞生長影響zui小的血清。不但增加工作量 ,而且如果因為一時篩選不出合適的血清還會導致生產停滯。

2 、動物來源成分

  因為來源于動物 ,所以有可能攜帶傳染源 ,包括病毒和有毒物質 ,任何一種傳染源都有可能對正在生長的細胞系或者制品帶來風險；不同來源的血清存在某些特異性病毒抗體（比如：乙腦抗體、牛腹瀉性病毒抗體等），直接影響接毒后病毒的復制，可能導致不產毒或毒價偏低，從而給疫苗生產造成巨大損失。  

3 、提高生產成本 

目前市場銷售的血清平均價格約 0.25元 /ml,按 10％添加量計算， 1L培養液中血清所占的成本是 25元，培養基及其他添加物的成本約為 6元，每升培養液的成本中血清約占 80％，由此可見血清在疫苗生產中占據了大量的生產成本。

4 、行業競爭導致質量難以提高  

由于國內牛血清生產廠家增多，而用戶的數量有限。為了獲得客戶資源，很多血清廠家都在進行低價銷售，行業內形成一種惡性的價格競爭。低價格帶來的結果就是低質量的血清。目前很多血清廠家都處于維持生存的狀態，因此難以投入大量資金和人力來提高血清的質量。

5 、血清蛋白引起的疫苗純化問題

由于血清含有大量的不同分子量的未知蛋白和多肽類物質，勢必會增加提取 ,分離 ,純化的步驟 ,增加了下游純化處理的難度 ,因此在疫苗純化階段給純化工作帶來很大的困難；疫苗產品中牛血清白蛋白殘留量要求不高于 50ng/劑，為達到純化的目的，純化工藝不得不添加新的儀器設備；在除去牛血清白蛋白殘留的同時，也會損失大量的有效目的產物，從而降低了疫苗的產率；牛血清中的某些蛋白與目的產物的分子量接近，在純化過程中不能*被去除，由于血清殘留而導致的生物制品不合格 ,或者因為雜蛋白含量大造成嚴重不良反應的情況時有出現 .因此也會嚴重影響疫苗產品的質量。

6 、相關法規對牛血清使用的規定

    為了使與傳染源相關的風險降到zui低，上存在多個國家之間限制進出口生物材料的法規；美國、歐盟和日本等發達國家和地區計劃在 2010年全面停止血清在生物制藥中的應用； FDA目前已不受理利用血清進行細胞培養的新藥申報； FDA與美國農業部已經嚴密控制胎牛血清在細胞培養中的使用，瘋牛病和口蹄疫的流行導致對牛血清控制使用更加嚴密； 2003年 4月， Vera Baumans和 Jan van der Valk組織召開題為 “改進體外培養技術方法，替換胎牛血清 ”的會議，討論 FBS的使用問題，在范圍內號召減少 FBS的使用；因此，預計政府部門對胎牛血清加工或使用的限制將會更加嚴厲。

藥品管理法對生物制品的質量提出嚴格要求，尤其是我國加入 WTO之后，在制品的質量上要求更嚴格。產品的市場競爭應主要靠質量競爭，所以對制品的主要原材料的質量要求也會越來越嚴格。牛血清作為生物制品生產所需的一種原材料，其質量的好壞直接關系到制品的質量和安全性，由牛血清給生物制品帶來的問題也日益凸現。細胞大規模培養及減少動物來源成分在生物制品中的使用已成為今后生物制藥發展的趨勢，為提高制品的質量和安全性，生物制品生產過程應盡量降低血清的使用量或尋找替代血清及動物組分的原材料。