總RNA提取試劑

RNAtrip

貨號(hào)：M090159

RNAtrip成功避開各種商業(yè)RNA提取試劑盒的種種弊端，采用技術(shù)和工藝，在提取過程中既能有效裂解組織細(xì)胞，強(qiáng)烈抑制RNA酶活性保護(hù)RNA免受降解，同時(shí)極為有效地分離去除DNA和蛋白質(zhì)。RNAtrip使RNA分離如同提取質(zhì)粒DNA一樣簡(jiǎn)單可靠，可在30-60分鐘內(nèi)完成，獲得*純度的總RNA沉淀，可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保護(hù)、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存: 4 ^oC密封避光保存兩年以上有效。然而因疏忽或冰箱意外停電，RNAtrip密封避光存放于25 ^oC室溫?cái)?shù)個(gè)月，品質(zhì)不受影響。

適用:

(1) 固體組織 (100 mg /ml ): 人、動(dòng)物、植物的各種新鮮或凍存組織。

(2) 培養(yǎng)細(xì)胞 (5~10× 10⁶細(xì)胞/ml): 真核細(xì)胞，細(xì)菌，酵母。

(3) 液體標(biāo)本(100 μl/ml): 全血、體液、尿液，病毒樣品等。

用戶實(shí)驗(yàn)用品和操作準(zhǔn)備

極微量的RNA酶都會(huì)導(dǎo)致RNA降解。分離RNA時(shí)RNA酶污染主要來自以下五個(gè)方面：(1) 來自實(shí)驗(yàn)人員的雙手。(2) 來自器皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細(xì)胞破碎不可避免地釋放內(nèi)源RNA酶。(4) RNA未能*與蛋白質(zhì)分離。(5) RNA沉淀和溶解時(shí)來自吸頭離心管和溶液。我們的Step by Step質(zhì)量監(jiān)測(cè)表明，RNAtrip可100％抑制RNA酶活性，并在分離步驟*清除RNA酶。因此在有RNAtrip存在的步驟中，使用高壓消毒20分鐘的吸頭離心管和溶液即可勝任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后，來自實(shí)驗(yàn)材料的RNA酶污染將會(huì)導(dǎo)致RNA降解，應(yīng)嚴(yán)格使用高壓滅活RNA酶的用品。戴手套無疑是有益的，但戴口罩和帽子則無必要。只要嚴(yán)格按照本指南進(jìn)行準(zhǔn)備和操作，使用RNAtrip總是能獲得高純度RNA。

1. 固體組織破碎設(shè)備。準(zhǔn)備下列裝置之一，1)玻璃勻漿器。必要時(shí)泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數(shù)次。2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨，清洗同玻璃勻漿器。3)組織細(xì)胞超聲破碎儀器。探頭插入裝滿蒸餾水的試管或燒杯中，開啟超聲清洗探頭30秒至1分鐘。4)高速機(jī)械勻漿器(Polytron，Tekmar或類似產(chǎn)品)。打開開關(guān)，在蒸餾水中清洗分散器頭數(shù)次。對(duì)這些裝置的部分部件高壓消毒30分鐘是保險(xiǎn)的措施，但使用RNAtrip這種處理并不必要。
2. 高壓蒸汽30分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA沉淀和溶解之后，應(yīng)嚴(yán)格使用高壓消毒的一次性用品。然而RNAtrip能在RNA酶污染環(huán)境下工作，在裂解步驟可使用未高壓但潔凈的一次性吸頭和離心管，但僅推薦在緊急情況下這樣做。比如由于不可預(yù)測(cè)的原因，動(dòng)物已經(jīng)處死，組織已取出，細(xì)胞已收取，而吸頭和離心管尚未高壓處理。這僅僅適用于RNAtrip試劑，對(duì)其它來源RNA提取試劑無效。此時(shí)保險(xiǎn)做法是使用普利萊基因技術(shù)公司的另種產(chǎn)品――組織RNA保護(hù)液(Cat# R1030)，用戶可把來不及處理的標(biāo)本保存在RNA保護(hù)液中，37 ^oC保存3天，25 ^oC保存2周，4 ^oC保存4周，－20 ^oC保存數(shù)月，固體或液體標(biāo)本中RNA不會(huì)降解。
3. DEPC處理的雙蒸水。加DEPC到水中至終濃度為0.01% v/v，室溫置夜，高壓消毒30分鐘。用于溶解RNA，配制TE緩沖液和75％乙醇。普通雙蒸水，高壓消毒30分鐘，用于沖洗器皿，配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。注意溶液配制后高壓滅菌，但瓊脂糖不能高壓處理。異丙醇，氯仿，純乙醇，分析純。電泳槽，雙蒸水沖洗。離心機(jī)和加樣器，無需處理。
4. 冰盒和濕冰。在冰上進(jìn)行操作有助于減少RNA降解。
5. 戴手套。提取質(zhì)粒DNA使用大量RNA酶，為防污染須特別清洗實(shí)驗(yàn)器具和實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

RNA提取程序

1. 組織細(xì)胞破碎與裂解

冰上操作。立即并快速破碎組織至關(guān)重要。組織細(xì)胞過量不僅使RNA得率下降，還將導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)污染。在緊急情況下，如動(dòng)物已處死，組織已取出，細(xì)胞已收取，異地取送標(biāo)本，用戶尚未做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)，推薦用戶把組織細(xì)胞儲(chǔ)存在RNA保護(hù)液(Cat# R1020)中，保證標(biāo)本中的RNA不降解。

(1) 固體組織。按比例每50-100 mg組織加1 ml RNAtrip試劑。用研缽研磨(僅適用于液氮凍存組織)：組織放在研缽中研成粉末，加1 ml RNAtrip試劑，繼續(xù)研磨至組織*裂解。用玻璃勻漿器勻漿：加入RNAtrip上下手動(dòng)勻漿組織10-15次。用高速機(jī)械勻漿器：將組織放入塑料試管內(nèi)，試管置冰浴燒杯中，加入RNAtrip試劑，將分散器頭垂直插入管內(nèi)與組織塊接觸，轉(zhuǎn)速12,000-20,000 rpm，上下移動(dòng)試管10-20次，直到組織*打散，無肉眼可見大塊。用超聲儀：需根據(jù)機(jī)器型號(hào)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，選取有效破碎組織的功率和時(shí)間。

注意：(1)通常用50-100 mg組織可獲得足量的RNA，對(duì)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木b綽有余。加入過量組織或過少RNAtrip容易導(dǎo)致提取失敗。(2)少量難以打碎的組織碎片不影響后續(xù)RNA提取。(3)用研缽和玻璃勻漿器勻漿破碎組織時(shí)，應(yīng)略微多加一些裂解液，以補(bǔ)充裂解產(chǎn)物粘在容器壁上造成的體積丟失。

(2) 培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞：棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞一次。每5-10′10⁶個(gè)細(xì)胞加1 ml RNAtrip試劑，但RNAtrip加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細(xì)胞表面。一個(gè)75 cm²瓶皿的細(xì)胞通常需要2 ml提取液，一個(gè)35 cm²瓶皿的細(xì)胞需要 1 ml提取液，更小的培養(yǎng)瓶皿可使用更少的提取液，但后續(xù)操作會(huì)因體積過小而極為不便。晃動(dòng)或用吸頭吹打使提取液流過并裂解所有細(xì)胞。置冰上5分鐘，傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一處以便取出。懸浮細(xì)胞：低速離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞快速重懸于50-100ml的PBS或去離子水中，每5-10′10⁶細(xì)胞加1 ml RNAtrip裂解。注意直接裂解未重懸的細(xì)胞沉淀，裂解物將十分粘稠而難以分散。細(xì)菌酵母：離心收集沉淀，加入50-100ml去離子水重懸細(xì)胞。每10⁷細(xì)胞加入1-2 ml RNAtrip直接裂解。某些細(xì)菌和酵母細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{破碎。

(3) 液體標(biāo)本：如體液、尿液、全血。每100ml液體樣品加1 ml RNAtrip，置冰上1-3分鐘。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。RNAtrip Liq (Cat# R1020)產(chǎn)品專門用于液體標(biāo)本RNA提取。

1. 將組織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，置冰上10分鐘。優(yōu)化步驟：如果組織裂解物含較多的碎片，或提取植物組織，12,000g 4 ^oC 離心10 分鐘，取上層裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪組織，12,000g 4 ^oC 離心10 分鐘，小心吸掉zui上面的油層，棄去。再取裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如帶少量油滴不影響提取。

3.  加入0.2體積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰浴5 分鐘，溶液分相。有時(shí)分相不明顯，不影響提取。

4.      12,000 ′ g 4 ^oC離心10分鐘，溶液分為兩相。RNA在上層水相，下層為有機(jī)相，兩相界面是一層薄膜其厚度與組織細(xì)胞類型和多少有關(guān)。小心吸出0.5ml上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管。注意：取上清液時(shí)應(yīng)保留0.5-1 mm厚的水相，以免擾動(dòng)和吸入下面的碎片和有機(jī)相。如果吸入，應(yīng)將所取的上清液放回管中并重新離心10分鐘，再次吸取水相。這一點(diǎn)至關(guān)重要，違背此原則容易導(dǎo)致RNA降解和DNA污染。如需同時(shí)提取DNA或蛋白質(zhì)，則保留中間相和下層有機(jī)相，向公司索要操作方法。

1. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于上清液充分混勻。冰上孵育10 分鐘沉淀RNA。用更低的溫度和更長的時(shí)間進(jìn)行沉淀并不必要。如果起始組織細(xì)胞的量很少，－20 ^oC放置一至數(shù)小時(shí)可沉淀幾乎所有的RNA。

注意：從富含多糖的植物組織或富含糖原的動(dòng)物肝臟組織提取RNA時(shí)，按以下步驟進(jìn)行：以每1 ml RNAtrip裂解組織，加氯仿后離心得到約0.5 ml上清液計(jì)算，分別加入上清液一半體積即0.25 ml 的高鹽溶液(0.8 M 檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)和0.25 ml異丙醇，混勻。執(zhí)行下面的離心沉淀步驟6。離心后可有效沉淀RNA，但多糖或糖原存留在上清可被棄去。從富含多糖的植物和動(dòng)物肝臟組織提取RNA時(shí)，推薦使用植物RNA分離試劑Plant RNAtrip或Plant RNA Extraction Kit。

1. 12,000 ′ g，4 ^oC 離心10分鐘。管底可見少許RNA沉淀。注意：如初始組織細(xì)胞量少，RNA將附著在管壁，用肉眼幾乎難辨沉淀，但不影響實(shí)驗(yàn)。如RNA 沉淀量很多并呈膠凍狀，通常表明有蛋白污染。應(yīng)仔細(xì)檢查操作步驟。

7.      棄上清。立即加入1 ml 75%乙醇，顛倒混勻數(shù)次洗滌沉淀。12,000 ′ g離心5分鐘。棄上清，盡量*吸去管壁上的液體。注意：乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4 ^oC保存一周或在－20 ^oC保存一年。

1. 敞開管口空氣干燥5-10分鐘使殘留液體揮發(fā)，RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自備的DEPC處理的高壓消毒純水或TE溶解沉淀。RNA溶液可保存于－70 ^oC或液氮中。注意：過分干燥將使RNA難以溶解。55 ^oC加熱或反復(fù)凍融數(shù)次可以助溶。RNA溶液加3倍體積乙醇凍存于－20 ^oC，用時(shí)離心沉淀。

說明

1. 每100 mg組織RNA預(yù)期得率為：肝脾60-100 mg, 腎50 mg, 腦組織10-15 mg, 胎盤20-40 mg, 脂肪50 mg。1 x 10⁷個(gè)細(xì)胞通常得50-100 mg。

1.        測(cè)定OD值，根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度。OD260/280比值可初步判斷RNA質(zhì)量，比值在1.6-2.0之間均屬正常。起始組織量過大，或吸取了有機(jī)相或碎片，將使RNA樣品中蛋白和雜質(zhì)含量高，RNA沉淀乙醇洗滌不充分(步驟7)，均可導(dǎo)致OD260/280比值降低。但切記OD260/280比值還受很多非質(zhì)量因素的影響。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或離子強(qiáng)度較高的溶液溶解時(shí)較高，但均不影響RNA后續(xù)使用。切記即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能達(dá)到看似的2.0左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否*的指標(biāo)。判斷RNA質(zhì)量的*途徑是進(jìn)行普通RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性。

1. 檢查RNA完整性。取1 mg RNA樣品進(jìn)行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。28S RNA~5 kb亮度應(yīng)該約為18S RNA~2 kb的兩倍，有時(shí)可見0.1-0.3 kb 的5S RNA。
2. 調(diào)整RNA溶液的體積或重沉淀RNA。（1）加入適量DEPC處理過的高壓消毒純水或TE緩沖液，于RNA溶液中，使溶液體積補(bǔ)齊到約400 ml；（2）加入 0.1 體積的3M 醋酸鈉 pH 5.2，混勻；（3）加入2.5體積的純乙醇，混勻；（4）冰上孵育10 分鐘；（5）12,000g 4 ^oC 離心10 分鐘，棄上清；（6） 執(zhí)行上述RNA提取程序的步驟6－8。
3. RNAtrip勿直接接觸皮膚和吸入。如接觸皮膚，立即用大量水清洗。