1．細胞培養

1.1培養基的配置：

⑴ 將一袋培養基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內殘留培養基洗下，并入容器。加注射用水（水溫20℃～30℃）到950毫升，輕微攪拌溶解。

⑵ 加入2.438克碳酸氫鈉。

⑶ 輕微攪拌溶解，加注射用水至1升。

⑷ 用1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol / L鹽酸溶液調pH至6.8-6.9。

⑸ 用0.2μm濾膜正壓過濾除菌。

⑹ 溶液應在2℃－8℃下避光保存。

1.2 胎牛血清的處理：

沒有滅活的血清中含有補體成分，需要將血清在60℃條件下滅活30 min。在水浴鍋內進行，滅活的過程中，要不停的搖晃，是受熱均勻，防止沉淀析出來。滅活后的胎牛血清分裝后放置-20℃，分裝的目的是為了防止血清的反復凍融。

1. CHO的復蘇

1.3.1 預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

1.3.2 取保存的安倍瓶迅速加入37度水浴鍋中，不斷搖動，保證1min內解凍。

1.3.3在超凈臺中加入37度預熱的DNEN 8mL至離心管中，同時加入細胞冷凍液，800rpm離心5min。

1．3.4棄上清加入37度預熱的DMEM和10%的太牛血清37度5%二氧化碳培養箱中置夜。

1.4 CHO細胞換液

（復蘇后的細胞，一般是在4小時或是18小時左右對培養基進行換液）

1.4.1預熱培養用液：把已經配好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

1.4.2 取出細胞培養板，用移液器吸出平板內的培養基，用PBS或是培養基清洗細胞，注意清洗時把清洗液緩緩延平板邊緣流進，防止用力過大吹起細胞。

1.4.3 加入培養基9ml，加1ml的胎牛血清。

1.4.4 37度5%的二氧化碳培養箱中培養置夜。

1.5 CHO細胞細胞的傳代

培養的細胞生長至一定密度之后，由于培養液中營養逐漸消耗、代謝物逐步積累（可見到培養液變黃），而且細胞的生長空間也受到限制，就會影響到細胞的繼續生存。這時就需要分離出一部分細胞和更新培養液，這一過程就叫做傳代。
1) 懸浮細胞的傳代
懸浮細胞可以直接將培養瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養液即可。 當細胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時，可以將懸液移到離心管內，800rpm離心5分鐘，棄上清，加入約2ml培養液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養液的培養瓶中。然后置于二氧化碳培養箱中培養（擰松培養瓶蓋）。
2) 貼壁細胞的傳代
(1) 將消化液（胰酶）從冰箱中拿出，放在室溫條件下預熱；
(2) 吸出全部培養液，沿壁緩緩加入消化液，將培養瓶有細胞面向下，加入消化液的量至剛好可以覆蓋為止約1ml，輕輕搖晃；
(3) 置于37℃消化2min左右，其間在顯微鏡下觀察，消化至細胞收縮變圓、部分脫落即可停止消化（加入血清即可停止消化），以防消化過度；
(4) 加入兩到三吸管含血清的培養液，終止消化；用吸管輕輕吹洗培養瓶有細胞的一面，以使細胞脫落干凈；
(5) 細胞懸液轉移至離心管內，800rpm離心5分鐘；

棄上清，加入培養液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養液（約8ml）的培養皿中，置于二氧化碳培養箱中培養。傳代的盤數根據細胞的數目確定，一般在3-4盤，傳代后的數目約為10⁴。

1.6 細胞計數

在操作臺上取一定量經離心過混合均勻的細胞溶液（約0.5ml）放到小的滅過菌的板上，取出離開操作臺后加入一定體積的0.4%的臺盼藍染色，取染色好的細胞培養液慢慢加入到細胞計數板上，要防止計數板上有空隙，然后在顯微鏡下數出細胞的數。（一般取對角的四個大格或中間的方格然后去平均值*10⁴）。

1.7.  細胞的凍存
細胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細胞內部形成冰晶對細胞造成傷害。
1) 貼壁細胞經消化、離心收集，懸浮細胞經離心收集；
2) 大約10⁶個細胞加入1ml凍存液（細胞培養液和10%DMSO），用吸管吹打，使細胞分散成單細胞懸液；
3) 加入到凍存管中。如用1.8ml的凍存管，每管不要加入超過1.5ml的細胞懸液；
4) 在凍存管上標明細胞名稱及凍存日期；
5) 用厚布或衛生紙包裹凍存管，置于4℃半小時，然后置于-20℃兩小時，再置于-40℃兩小時，然后置于液氮上方置夜；第二天將細胞置于液氮中；如果僅想提取細胞內的東西可以直接放在-20度的冰箱中。
6) 記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄。