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質粒DNA質量如何評估才可靠?

來源:上海北諾生物科技有限公司   2015年01月13日 15:09  

質粒抽提過程中有很多步驟會影響zui后的產量和質量,那么如何評估質粒DNA的產量和質量呢?

       目前使用分光光度法定量質粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進行質粒DNA產率和質量的分析是兩種zui常用的方法。

       溶液中的核酸濃度可通過260 nm的吸光度方便地進行計算。A260的數值處于0.1至1.0之間時測量結果具有良好的重復性,但當A260數值小于0.1或大于1.0的時候,結果的可重復性將顯著下降。而且,3.0以上的讀值是無法使用的,它可能會潛在導致對DNA質量的低估。因此,為了獲得可靠的DNA分光光度定量結果,A260的讀值需要處于0.1至1.0之間。當檢測小量DNA時,使用瓊脂糖凝膠電泳進行的定量分析可能更為可靠。

       造成較低的產率和質量的可能因素有很多。為了確定存在問題的環節,可于每一純化步驟都保留一小部分樣品,并通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

制備樣本

如各個實驗方案和下列表格中所示,從澄清裂解液(樣本1)、流出液(樣本2)、QC洗滌緩沖液的混合組分(樣本3)和QF/QN緩沖液洗脫產物(樣本4)中各取出部分樣品。使用1倍體積的異丙醇沉淀核酸,并使用70%的乙醇洗滌該沉淀,充分蒸干后重懸于10 μl pH8.0的TE緩沖液中。

表一 瓊脂糖凝膠分析所需樣本體積

樣本

實驗方案步驟

Midi

Maxi

Mega

Giga

(極低拷貝數質粒/科斯質粒) 
QIAGEN-tip 100

(極低拷貝數質粒/科斯質粒)QIAGEN-tip 500

1


240 μl

120 μl

120 μl

75 μl

600 μl

750 μl

2


240 μl

120 μl

120 μl

75 μl

50 μl

24 μl

3


400 μl

240 μl

160 μl

120 μl

200 μl

120 μl

4


100 μl

60 μl

22 μl

20 μl

50 μl

30 μl

(制備產物占樣本量的百分比)

2%

0.40%

0.08%

0.02%

1%

0.20%

瓊脂糖凝膠分析

在1%的瓊脂糖凝膠*中,對于各個質粒純化步驟中的對應樣品各加入2 μl進行電泳。

以上信息來源于:

http://www.qiagen。。com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/reliability%20of%20dna%20quantification%20by%20spectrophotometry/ 

http://www.qiagen。。com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/agarose%20gel%20analysis%20of%20the%20purification%20procedure/ 

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