大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)酶聯(lián)免疫檢測

試劑盒使用說明書

使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于生物素雙抗體夾心技術(shù)原理，來檢測大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX))，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學診斷。

用    途： 用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中NADPH氧化酶(NADPH-OX)的測定。

工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的水平。向預先包被了大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)單克隆抗體的酶標孔中加入NADPH氧化酶(NADPH-OX)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗NADPH-OX抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

需要而未提供的試劑和器材

1．37℃恒溫箱。

2． 標準規(guī)格酶標儀。

3． 精密移液器及一次性吸頭

4． 蒸餾水，

5． 一次性試管

6． 吸水紙

注意事項

1． 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。

3． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。

4． 為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

5．  不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

6．  底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

標本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

操作程序

1．  標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：

2．  根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

3．  加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗NADPH-OX抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50μl，鏈霉素-HRP50μl（標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；3)待測樣品孔:加入樣本40μl，然后各加入抗- NADPH-OX抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。

4．  配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

5．  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6．  顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。

7．  終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

8．  測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。

9.根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。

操作程序總結(jié)：

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，生物素標記二抗和酶標試劑，37℃反應60分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內(nèi)讀OD值

計算

檢測范圍：10 pg/ml→300pg/ml。

規(guī)格：    48T/盒

保存：    2-8℃

有效期：  6個月（2-8℃）。