Caspase3 的激活在凋亡過程的細胞事件啟動中起著重要作用，有證據表明，在蛋白酶級聯切割過程中，Caspase 3處于核心位置。本法運用熒光酶聯免疫吸附法（flurometric immunosorbent enzyme assay， FIENA）的原理， Caspase3激活后會作用于其特異的底物：乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酰胺（Ac-DEVD），如將Ac-DEVD與熒光素連接（Ac-DEVD-AFC），即會產生熒光裂解產物AFC，而且caspase3的活性與Ac-DEVD-AFC的分解量或自由熒光產生熒光的強弱成正比。本法可用于各種培養細胞凋亡誘導研究，而且靈敏度高，特異性強（特異性的抗caspase 3單克隆抗體），與其他已知的caspases無交叉反應。

材料與試劑

1. 20x包被緩沖液 ；

2. 20x抗caspase3抗體；

3. 封閉緩沖液；

4. 孵育緩沖液；

5. 100xDTT；

6. 20x底物Ac-DEVD-AFC；

7. AFC；

8. 陽性對照： 凋亡細胞U937細胞裂解液；

9. 微孔板。

操作步驟

1. 樣品制備： 以適當方法誘導（如2x106 個細胞）凋亡（1-24小時）。誘導后，以冷PBS洗滌細胞并離心（300xg）5分鐘，收集細胞。設置未經誘導的陰性對照；

2. 重懸細胞， 加入細胞裂解液與之作用，冰上1分鐘。 待細胞裂解后可以于-20°c儲存一周；或直接離心，室溫1分鐘，取細胞溶解液100μl用于測定；

3. 包板：用抗Caspase 3 抗體包被液包被微孔板，孵育37℃ 1小時或4℃。 用封閉緩沖液于室溫條件下作用30min，以封閉非特異性結合。棄去封閉緩沖液，并用孵育緩沖液洗三次；

4. 測定Caspase 3活性：將樣本（細胞裂解液100μl、陰性對照、陽性對照）加至抗caspase 3 包被MTP的微孔中，37℃孵育1小時， 棄去未結合標本， 以孵育緩沖液于室溫洗板3 次，每次1min。 加入新鮮配制的Caspase底物溶液， 37℃ 反應1~3小時； 然后進行熒光光度檢測， 激發波長400nm， 發射波長為505nm。

結果判斷

Caspase 3的活性與AC-DEVD-AFC的分解量或自由熒光產生熒光的強弱成正比。

注意事項

此法特異性高，可在106 細胞裂解物中檢測出5%的凋亡細胞率。 然而，對特定樣本中的檢測下限則隨凋亡過程的動力學，誘導凋亡的試劑，以及在細胞總數中受影響的細胞數而異。