1、 黑膠蟲(chóng)概況：

　　在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，有時(shí)會(huì)在400倍顯微鏡下看到小黑點(diǎn)在動(dòng)，小黑點(diǎn)有時(shí)呈點(diǎn)狀，有時(shí)呈小的片狀，運(yùn)動(dòng)形式為在原地振動(dòng)（類(lèi)似布朗運(yùn)動(dòng)），這種小黑點(diǎn)既不是細(xì)菌、霉菌，也不是支原體（我們?cè)?jīng)請(qǐng)周守長(zhǎng)用血平板培養(yǎng)過(guò)，沒(méi)有菌落出現(xiàn)），目前業(yè)內(nèi)人士稱(chēng)其為“黑膠蟲(chóng)”。

　　黑膠蟲(chóng)到底是否為生物？這個(gè)一直是業(yè)內(nèi)人士的疑惑。黑膠蟲(chóng)一般是存在血清里的，而血清通常是經(jīng)過(guò)0.1μm濾膜過(guò)濾的,所以血清里不可能存在細(xì)菌、霉菌及支原體等微生物。如果說(shuō)黑膠蟲(chóng)不是生物，它會(huì)不斷增多，達(dá)到一定數(shù)量時(shí)會(huì)與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)，從而使得細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。

　　不管對(duì)于黑膠蟲(chóng)的爭(zhēng)論如何,但有幾個(gè)是目前大家*的：

　　① 與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有不利影響。

　　② “黑膠蟲(chóng)”會(huì)增殖，增殖多時(shí)，視野下一大片都為“黑膠蟲(chóng)”。

　　③ “黑膠蟲(chóng)”與血清有關(guān)，與血清質(zhì)量有很大關(guān)系。

　　2、目前對(duì)“黑膠蟲(chóng)”的定論：有2種解釋?zhuān)?/span>

　　*， 黑膠蟲(chóng)為生物。它是小于細(xì)菌的生物，直徑小于0.1μm，大多國(guó)外血清中多見(jiàn)，可能是國(guó)外牛血清中含有的某種原蟲(chóng)。只要它是生物，那么在培養(yǎng)基中一定會(huì)對(duì)細(xì)胞有影響。

　　第二， 黑膠蟲(chóng)不是生物。國(guó)內(nèi)的血清中，通常滅活之后都會(huì)有絮狀沉淀出現(xiàn)，而黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)時(shí)，所使用的血清被反復(fù)凍融過(guò)多次。所以推測(cè)，所謂的“黑膠蟲(chóng)”其實(shí)就是血清中的某些蛋白成分的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)滅活之后喪失活性，在培養(yǎng)基中，鏡檢見(jiàn)到的運(yùn)動(dòng)其實(shí)是這些物質(zhì)在溶液中做“布朗運(yùn)動(dòng)”。隨著細(xì)胞消耗培養(yǎng)基，這些物質(zhì)越來(lái)越多，zui后細(xì)胞所用的營(yíng)養(yǎng)消耗完，細(xì)胞容易死亡。

　　3、對(duì)于“黑膠蟲(chóng)”的處理方法：

　　首先，血清買(mǎi)回來(lái)滅活前凍融應(yīng)逐級(jí)凍融，即按照-20℃——4℃*融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導(dǎo)致血清中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性。

　　第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數(shù)。分裝時(shí)注意無(wú)菌。

　　第三，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)血清濃度稍大一些。通常細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數(shù)過(guò)多，那營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性，按15%的濃度配制事實(shí)上達(dá)不到15%的營(yíng)養(yǎng)成分，故培養(yǎng)基配置時(shí)一般用18%-20%的血清。

　　這種黑膠蟲(chóng)，在國(guó)外稱(chēng)其為- 納米細(xì)菌，現(xiàn)將我看到的一些資料轉(zhuǎn)述如下，希望對(duì)大家有所幫助：

　　1.納米細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)

　　芬蘭的一個(gè)科學(xué)家Ciftcioglu et al 在其細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中, 發(fā)現(xiàn)在胎牛血清中存在一種直徑50-500 nm的微粒; 這種顆粒物對(duì)伽瑪射線具有很強(qiáng)的耐受性; 針對(duì)包括支原體在內(nèi)的所有已知微生物的特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均為陰性; 這種顆粒物在血瓊脂培養(yǎng)基以及支原體培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng), 通常的細(xì)菌染色方法難以著色. 因此, Kajander判定這是一種新的微生物, 根據(jù)其體型微小并且棲息在血液中的特點(diǎn), 將其命名為Nanobacterium sanguineum, 簡(jiǎn)稱(chēng)Nanobacteria, 中文譯名納米細(xì)菌, 并將菌種保存于德國(guó)微生物存儲(chǔ)中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany).

　　2 納米細(xì)菌的生物學(xué)特性

　　2.1 納米細(xì)菌——哺乳動(dòng)物體內(nèi)zui小的細(xì)菌 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所使用的血清通常采用過(guò)濾法達(dá)到無(wú)菌的目的, 通常采用直徑0.1 μm的濾膜過(guò)濾除菌. Kajander研究發(fā)現(xiàn), 0.1 μm

　　的濾膜過(guò)濾并不能有效地清除血清中的納米細(xì)菌, 但是血清經(jīng)過(guò)0.05 μm的濾膜過(guò)濾則能有效清除納米細(xì)菌污染. 細(xì)胞培養(yǎng)條件下的納米細(xì)菌經(jīng)過(guò)0.2 μm的濾膜過(guò)濾后約有3%的納米細(xì)菌可以通過(guò)濾膜, 而在加壓過(guò)濾的情況下, 約有50%的納米細(xì)菌可以通過(guò)0.2 μm的濾膜. 剛剛經(jīng)過(guò)過(guò)濾的納米細(xì)菌在相差顯微鏡下無(wú)法發(fā)現(xiàn), 但在不含血清添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后, 即可以用相差顯微鏡觀測(cè)到. 電子顯微鏡觀察顯示, 納米細(xì)菌的平均直徑為200 nm, 而子代納米細(xì)菌的zui小直徑僅50 nm. 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為, 只有當(dāng)細(xì)胞直徑在不低于140 nm時(shí), 才能維持其zui基本的新陳代謝. Kajander認(rèn)為, 納米細(xì)菌可能是地球形成早期、在原始大氣條件下的一種zui原始的生命形式, 因此不能用衡量已經(jīng)經(jīng)過(guò)幾十億年進(jìn)化的生命形式的觀點(diǎn)去衡量這種古老的生命形式, 并且推測(cè), 納米細(xì)菌遭受不良因素的侵害后可以形成許多的體形微小的碎片, 并將其釋放到環(huán)境中, 每一個(gè)碎片都可能攜帶部分遺傳信息, 在特定條件下, 這些"基本"顆粒聚集在一起形成群落, 當(dāng)足夠數(shù)量的"基本"顆粒提供完整的遺傳信息時(shí), 則可以形成新的納米細(xì)菌.

　　2.2 納米細(xì)菌緩慢的增殖周期

　　微生物學(xué)家通常是通過(guò)對(duì)某種微生物進(jìn)行培養(yǎng), 進(jìn)而了解該種微生物的特性. 然而, 并非每種微生物都是可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)的,主要原因在于這些微生物的培養(yǎng)條件我們并不清楚, 其生存環(huán)境以及是否與其他微生物存在共生關(guān)系我們并不十分了解. 納米細(xì)菌就是一種對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求非常苛刻的微生物, 其新陳代謝率極為緩慢, 僅為普通細(xì)菌的1/10 000. 研究發(fā)現(xiàn), 納米細(xì)菌主要利用環(huán)境中的氨基酸而不是葡萄糖來(lái)提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 ℃有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空氣存在的潮濕環(huán)境下, 并且在含有100 mL/L胎牛血清和適量谷氨酰胺的pH值7.4的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 納米細(xì)菌能夠緩慢生長(zhǎng), 平均倍增時(shí)間為3 d,而在無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 其增殖速度變慢, 細(xì)菌倍增時(shí)間可延長(zhǎng)至5-6 d, 在添加適量促納米細(xì)菌生長(zhǎng)因子BGF(一種桿菌培養(yǎng)上清的超濾液)或N3(納米細(xì)菌培養(yǎng)上清的超濾液)的條件下, 其增殖速度加快, 倍增時(shí)間可縮短至0.6-1 d. 在有促納米細(xì)菌生長(zhǎng)因子BGF存在的條件下, 納米細(xì)菌甚至可以在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng), 并形成直徑l mm大小的細(xì)菌集落.

　　2.3 納米細(xì)菌*的生物礦化現(xiàn)象

　　當(dāng)在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌被轉(zhuǎn)移至不含血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時(shí) (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之內(nèi)就可以觀察到納米細(xì)菌出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象, 在1 wk之內(nèi), 就可以在納米細(xì)菌的周?chē)纬蓭孜⒚缀竦纳锉荒?/span> (biofilm), 并且緊緊貼附于培養(yǎng)瓶底部, 而納米細(xì)菌棲息其中(這與在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌的形態(tài)明顯不同), 此時(shí)其大小接近于一個(gè)酵母細(xì)胞, 2-3 wk以后, 由于生物被膜的增厚, 其直徑已近似于一個(gè)紅細(xì)胞的大小. 用EDX法對(duì)這種生物被膜的化學(xué)組成進(jìn)行分析, 顯示其鈣磷的峰值與羥基磷灰石極其相似, 電子顯微鏡觀察以及傅立葉轉(zhuǎn)換紅外頻譜(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析顯示其主要成分為碳酸羥基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不論在有無(wú)血清作為添加劑的情況下, 都可以見(jiàn)到這種被羥基磷灰石包繞的納米細(xì)菌, 這種情況甚至可以在處于分裂期的納米細(xì)菌中見(jiàn)到. 納米細(xì)菌并不產(chǎn)生尿激酶和堿性磷酸酶, 并且即便經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的培養(yǎng), 其培養(yǎng)基的pH值也不會(huì)出現(xiàn)明顯的變化, 一直穩(wěn)定在7.4左右, 這表明在納米細(xì)菌細(xì)胞膜表面所生成的羥基磷灰石結(jié)晶是源自于生物大分子的, 即生物礦化現(xiàn)象, 而并非是由于pH值改變所導(dǎo)致的簡(jiǎn)單的物理結(jié)晶現(xiàn)象.納米細(xì)菌利用培養(yǎng)體系中的鈣、磷合成羥基磷灰石作為其生物被膜的主要成分, 這種生物礦化過(guò)程受到生長(zhǎng)環(huán)境中某些因素的調(diào)控, 從而使其呈現(xiàn)不同的外觀, 如羥基磷灰石形、細(xì)菌被膜形、沙粒形、結(jié)石形和類(lèi)似腫瘤的外形. （這也許就是國(guó)內(nèi)的一些研究者們認(rèn)為其是一些磷酸鹽類(lèi)的無(wú)機(jī)物的部分原因吧！）。在含有新鮮血清的培養(yǎng)基中納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象程度較輕微, 這是由于血清中含有強(qiáng)效羥基磷灰石合成抑制因子, 骨鈣素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由于這些抑制蛋白的存在, 所以在有血清存在的情況下, 納米細(xì)菌的生物礦化作用受到明顯抑制. 當(dāng)血清濃度降低時(shí), 納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象增強(qiáng), 在不含血清的培養(yǎng)體系中, 生物礦化現(xiàn)象劇烈而迅速. 盡管改良的Loeffler固體培養(yǎng)基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在滅菌過(guò)程中受到破壞, 所以在此培養(yǎng)基中的納米細(xì)菌的礦化作用并不受抑制, 在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的納米細(xì)菌其菌落直徑可達(dá)1-5 mm. 另外, 當(dāng)有乙二胺四乙酸(EDTA)存在時(shí), 納米細(xì)菌的生物現(xiàn)象會(huì)受到明顯的抑制.由于礦化生物被膜的保護(hù)作用以及極其緩慢的新陳代謝率, 使納米細(xì)菌能夠耐受各種不利的物理?xiàng)l件和化學(xué)損傷因素以及多種抗生素的打擊.

2.4納米細(xì)菌的檢測(cè)方法 由于納米細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)微生物培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng), 并且即便是在zui適宜其生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中, 納米細(xì)菌的生長(zhǎng)也極為緩慢, 其新陳代謝率僅為普通細(xì)菌的萬(wàn)分之一, 這使得許多基于檢測(cè)細(xì)菌新陳代謝的微生物學(xué)方法無(wú)法檢測(cè)納米細(xì)菌的存在. 由于納米細(xì)菌難以用傳統(tǒng)的火焰法和乙醇法固定, 并且大多數(shù)染料無(wú)法穿透其細(xì)胞壁, 而且不能用普通顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察, 因此常規(guī)的細(xì)菌學(xué)染色法并不能檢測(cè)到納米細(xì)菌的存在. 通過(guò)Kajander et al 的研究, 發(fā)現(xiàn)70℃干烤10 min, 可以將其有效固定; 另外, 用茜素紅S、剛果紅以及硝酸銀染料可以使納米細(xì)菌著色; 而培養(yǎng)狀態(tài)下的納米細(xì)菌可以在放大400倍的相差顯微鏡下清晰地觀察其生長(zhǎng)情況; 用DNA熒光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通細(xì)菌DNA染色的條件對(duì)納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色均不成功, 而當(dāng)按照線粒體DNA以及病毒DNA染色條件, 對(duì)納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色時(shí), 熒光顯微鏡下可以觀察到特征性的熒光; 用納米細(xì)菌特異性抗體進(jìn)行熒光染色也可以清晰地顯示納米細(xì)菌的存在; 利用電子顯微鏡對(duì)經(jīng)過(guò)負(fù)染的納米細(xì)菌進(jìn)行觀察, 可以清晰的顯示80-350 nm大小、單獨(dú)或聚集成簇的納米細(xì)菌以及其表面的生物被膜(biofilm)結(jié)構(gòu); 而用透射電鏡對(duì)納米細(xì)菌的超薄切片進(jìn)行觀察, 可以清晰的顯示其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1988年芬蘭科學(xué)家Kajander等進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在一種原核微生物，能通過(guò)100nm的濾菌器，1990年Kajander等將此種微生物命名為納米細(xì)菌(nanobacteria)。

　　微生物學(xué)特性

　　納米細(xì)菌是革蘭陰性菌，呈球狀或球桿狀，細(xì)胞壁厚，無(wú)莢膜與鞭毛結(jié)構(gòu)，約20-200，可通過(guò)0.1-0.4μm的濾菌膜，體積極小，通過(guò)電子顯微鏡和其它的高分辨率顯微鏡（如原子顯微鏡）可發(fā)現(xiàn)。納米細(xì)菌在pH7.4和生理性鈣磷濃度中能形成羥磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，產(chǎn)生堅(jiān)硬的鈣化外殼覆蓋于菌體周?chē)诟邷亍?qiáng)酸等條件下仍能存活。納米細(xì)菌不能用

　　普通微生物培養(yǎng)液培養(yǎng)，但能用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

　　納米是長(zhǎng)度單位

　　納米細(xì)菌是目前世界上zui小的細(xì)胞生物,比支原體還要小.

　　中國(guó)臺(tái)灣成功大學(xué)和美國(guó)洛克菲勒大學(xué)的科學(xué)家在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》上發(fā)表論文稱(chēng)，基于DNA繁殖模式的生物zui小直徑要在200納米以上，所以納米細(xì)菌并非生物。

　　研究人員通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：健康人類(lèi)血清中的納米細(xì)菌以復(fù)合碳酸鈣為成分，不包含DNA或RNA的痕跡，應(yīng)該不是以生物方式生成的。之前研究也有類(lèi)似看法，但沒(méi)有給出納米細(xì)菌的化學(xué)構(gòu)成。此次則提出了一個(gè)納米細(xì)菌生長(zhǎng)的化學(xué)模型，根據(jù)這一假說(shuō)，人們能通過(guò)改變碳酸鈣沉淀所需的基質(zhì)，去控制納米細(xì)菌生長(zhǎng)的速度和形狀。

　　科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，羥磷灰石只在特定狀態(tài)下，比如與抑制晶體生長(zhǎng)蛋白質(zhì)混合時(shí)，才聚集在納米細(xì)菌周?chē)f(shuō)明羥磷灰石并非納米細(xì)菌生長(zhǎng)所必需。

　　(PNAS 2008 105: 5549-5554; published online on April 2, 2008, 10.1073/pnas.0711744105 )

細(xì)胞培養(yǎng)中的黑膠蟲(chóng)污染

摘要：預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，黑膠蟲(chóng)（也稱(chēng)黑焦蟲(chóng)）是近幾年來(lái)幾乎出現(xiàn)在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。但是現(xiàn)在無(wú)法對(duì)黑膠蟲(chóng)的確認(rèn)和鑒別，導(dǎo)致學(xué)術(shù)界說(shuō)法不一，筆者收集了關(guān)于黑膠蟲(chóng)的資料，對(duì)黑膠蟲(chóng)進(jìn)行類(lèi)系統(tǒng)描述，對(duì)黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)的情況對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響以及黑膠蟲(chóng)污染后的有效處理進(jìn)行介紹。

(Grade 2005, Biotechnology, School of Life Science and Engineering)

Abstract Pollution prevention is the key to success in cell culture, black dots (also called black particles) almost appeared in every cell culture laboratory in past few years .But now no one able to confirm and identify what the black dots is. This lead to appear different academic arguments.The author collected information about the black dots to make a description about black spots which similar to the systemic description,and Introduce when aand where the black dots come out. At the same time give some advice to deal with the black dots.

前言

污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。一開(kāi)始就要十分重視，防止污染，否則會(huì)前功盡棄，不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚至造成無(wú)法彌補(bǔ)的損失。細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的生物污染類(lèi)型有7種，分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲(chóng)污染、黑膠蟲(chóng)污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染。他們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)中污染的特點(diǎn)如下：

1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。

2、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國(guó)內(nèi)血清很多都沒(méi)有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中zui常見(jiàn)的微生物之一。而且它不能用過(guò)濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。

3、黑膠蟲(chóng)：可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無(wú)明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無(wú)明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。

4、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開(kāi)始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。

5、原蟲(chóng)：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，zui終形成惡性循環(huán)。

6、 病毒：組織細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題

7、非同種細(xì)胞污染 ：即是細(xì)胞交叉污染，由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

在上述的八種污染物中，黑膠蟲(chóng)是現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)中討論比較多的，但大多數(shù)文獻(xiàn)未對(duì)其進(jìn)行描述或一帶而過(guò)，就像上面關(guān)于描述黑膠蟲(chóng)的情況是不完整，還有很多不明的情況。對(duì)其身份有多種猜測(cè)，到現(xiàn)在都沒(méi)有地對(duì)黑膠蟲(chóng)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)上的歸類(lèi)。黑膠蟲(chóng)到底是不是一種生物，如果是那黑膠蟲(chóng)會(huì)是何種生物，如果不是，那黑膠蟲(chóng)會(huì)是什么？一系列的問(wèn)題都懸在奮斗在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者們的心中。

一、關(guān)于黑膠蟲(chóng)的描述

1、分類(lèi)上的描述

對(duì)于黑膠蟲(chóng)的分類(lèi)，學(xué)術(shù)界沒(méi)有明確給予說(shuō)法。關(guān)于黑膠蟲(chóng)的分類(lèi)，目前大部分人認(rèn)為黑膠蟲(chóng)污染是微生物感染。在一些文章論述上把黑膠蟲(chóng)歸為生物污染類(lèi)型，但是沒(méi)把它歸為確定的生物分類(lèi)類(lèi)型，只是把黑膠蟲(chóng)獨(dú)立為一種未知生物。而根據(jù)中國(guó)病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲(chóng)，似乎和草履蟲(chóng)和變形蟲(chóng)有類(lèi)似之處，但是由于課題經(jīng)費(fèi)不夠而不能繼續(xù)下去，zui終也沒(méi)有有力證明黑膠蟲(chóng)是屬于原蟲(chóng)。也有一些學(xué)者不認(rèn)為所謂的黑膠蟲(chóng)污染是一種生物污染，而認(rèn)為是細(xì)胞碎片類(lèi)物質(zhì)，是在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞衰亡破裂產(chǎn)生的；也有在文獻(xiàn)中報(bào)道說(shuō)是玻璃瓶中類(lèi)似氧化硅的物質(zhì)，那個(gè)文獻(xiàn)很少人找得到；還有報(bào)道黒膠蟲(chóng)是一種納米級(jí)的細(xì)菌。

2、形態(tài)上的描述

形態(tài)上類(lèi)似與桿狀細(xì)菌，但長(zhǎng)度比細(xì)菌長(zhǎng)，直徑約在0.5~1微米，不染色觀察為黑色；膠蟲(chóng)成熟后呈線狀，而且形態(tài)是橢圓形。

3、運(yùn)動(dòng)形式

在400X倒置顯微鏡小，有典型的布朗運(yùn)動(dòng)（不規(guī)則的原地小距離抖動(dòng)），即很多細(xì)胞培養(yǎng)者看到的，像黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去。可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去。但是在物理學(xué)上來(lái)說(shuō)，顆粒足夠小，在液體中也是做布朗運(yùn)動(dòng)的，這不足以說(shuō)明黑膠蟲(chóng)的布朗運(yùn)動(dòng)就證明它是生物。

4、生理上的描述

（1）抗性

抗細(xì)菌和抗霉菌的藥物對(duì)黑膠蟲(chóng)均無(wú)效，可以保守的判定黑膠蟲(chóng)不屬于細(xì)菌。

（2）環(huán)境抗逆性

將培養(yǎng)器材150度烘烤8小時(shí)，可以消除，這個(gè)黑膠蟲(chóng)高壓滅菌泡酸都不死。可見(jiàn)黑膠蟲(chóng)可以耐高溫高壓，而且還有點(diǎn)嗜酸，如果證實(shí)它是生物的話，那它很有可能是微生物，一種古菌。

（3）營(yíng)養(yǎng)條件

“黑膠蟲(chóng)”可寄生于動(dòng)物細(xì)胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細(xì)胞和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)為生，并隨細(xì)胞傳代而傳代。可見(jiàn)“黑膠蟲(chóng)”是一種異養(yǎng)生物。

二、對(duì)黑膠蟲(chóng)的各種猜測(cè)及相應(yīng)的處理

1、非生物類(lèi)

（1）細(xì)胞碎片類(lèi)

在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候， 由于細(xì)胞代謝、物質(zhì)交換、周邊環(huán)境變化，尤其是在從37度培養(yǎng)箱中拿出來(lái)觀察的過(guò)程中，由于液體培養(yǎng)基的比熱較大，液內(nèi)溫度高于外界溫度，造成冷熱交換、小范圍內(nèi)形成液體流動(dòng)加劇，當(dāng)然這些小歲末就會(huì)被攪動(dòng)起來(lái)形成似乎“游動(dòng)”的感覺(jué)；隨著細(xì)胞培養(yǎng)的繼續(xù)，部分細(xì)胞開(kāi)始衰亡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂，破裂之后的細(xì)胞內(nèi)容物泄露到培養(yǎng)液中。尤其是溶酶體的破壞，連續(xù)性地造成其他細(xì)胞和細(xì)胞器的損傷，如果換液不很勤，又會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步破壞和殘?jiān)某霈F(xiàn)；再者，“黑焦蟲(chóng)”問(wèn)題是很多細(xì)胞培養(yǎng)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題，但到目前為止尚未找到其監(jiān)測(cè)和排除的試劑和手段，這首先是由于所謂“黑焦蟲(chóng)”病原體根本難以收集和捕捉， 這也從另一個(gè)側(cè)面證明了“黑焦蟲(chóng)”問(wèn)題的難以確定性；再說(shuō)任何一種外來(lái)的微生物在培養(yǎng)基中都會(huì)有生命活動(dòng)的反應(yīng)和表現(xiàn)，而不是簡(jiǎn)單地運(yùn)動(dòng)那樣的外觀性表現(xiàn)。舉一個(gè)例子：如果“黑焦蟲(chóng)”的運(yùn)動(dòng)狀況已經(jīng)到了用顯微鏡已經(jīng)可以觀察出的程度，其營(yíng)養(yǎng)代謝和能量需求也就可想而知。這樣，培養(yǎng)液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發(fā)生明顯變化。比如說(shuō)：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，細(xì)胞大量破碎死亡、引發(fā)其它類(lèi)型微生物侵染等等。而這些狀況，在所謂的“黑焦蟲(chóng)”感染中，是很難觀察到的。同時(shí)“黑焦蟲(chóng)”的出現(xiàn)而影響細(xì)胞狀態(tài)似乎得不到有力的證據(jù)。倒是細(xì)胞狀態(tài)下降的時(shí)候，“黑焦蟲(chóng)”明顯增多了。很有可能是細(xì)胞狀態(tài)下降時(shí)，細(xì)胞衰亡產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。所以黑膠蟲(chóng)屬于細(xì)胞碎片是比較可能和合理的。

（2）玻璃培養(yǎng)瓶中的類(lèi)似氧化硅的東西

網(wǎng)上有一篇文章說(shuō)，黑膠蟲(chóng)其實(shí)不是一種生物，是無(wú)機(jī)物，其本質(zhì)是玻璃培養(yǎng)瓶里的硅顆粒。可影響細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)，不明顯。細(xì)胞狀態(tài)較差，數(shù)量少時(shí)才容易看到，的辦法是用一次性培養(yǎng)瓶，可消除黑膠蟲(chóng)影響。

（3）血清聚合物產(chǎn)物

gibco公司的血清說(shuō)明，此物為血清聚合產(chǎn)物，而不是微生物。

2、生物類(lèi)

（1）支原體

有人曾認(rèn)為黑膠可能是支原體污染，因?yàn)橄鄬?duì)比較的文章指出，黑膠蟲(chóng)可以通過(guò)濾膜，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實(shí)驗(yàn)室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實(shí)驗(yàn)證明黑膠蟲(chóng)不會(huì)是支原體，原因如下：光鏡下可見(jiàn), 因?yàn)轶w積不對(duì)，支原體在普通顯微鏡下不能看到；多種染色后可見(jiàn)，甚至hoechst即能將它染色,一般來(lái)說(shuō)支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。所以，黑膠蟲(chóng)是一種支原體的可能性比較小。

（2）真菌

有很多人發(fā)現(xiàn)類(lèi)似黑膠蟲(chóng)的，但zui后確定是真菌，二性霉素B對(duì)其有效。那說(shuō)明黑膠蟲(chóng)不存在只是細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌感染，還是說(shuō)明黑膠蟲(chóng)污染屬于真菌類(lèi)污染物。如果黑膠蟲(chóng)是一種真菌，那么由此引起的污染是不會(huì)引起那么多人的關(guān)注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認(rèn)為“黑膠蟲(chóng)”是真菌的細(xì)胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細(xì)胞被感染了，要進(jìn)行拯救處理，不像理論上那么簡(jiǎn)單，稍有不注意都是很容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，所以黑膠蟲(chóng)是一種真菌也是不太可能。

（3）寄生類(lèi)原蟲(chóng)

黑膠蟲(chóng)屬于寄生類(lèi)的原蟲(chóng)，而不是細(xì)菌、支原體，也不是什么補(bǔ)體、細(xì)胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲(chóng)有兩種不同形態(tài)，一種較大，運(yùn)動(dòng)較慢，泛紅光；另一種較小，運(yùn)動(dòng)較快，紅中帶綠，個(gè)小的圍著個(gè)大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開(kāi)細(xì)胞就不能存活，也有人做過(guò)這樣的試驗(yàn)，單純培養(yǎng)過(guò)污染膠蟲(chóng)的血清4周，直到滿(mǎn)視野都是黑煤渣般的膠蟲(chóng)。給人的感覺(jué)是膠蟲(chóng)和細(xì)胞一樣有叢集性，如果膠蟲(chóng)密度低則生長(zhǎng)緩慢，如果手懶，拖了幾天沒(méi)換液，待膠蟲(chóng)生長(zhǎng)到一定濃度后便會(huì)飛速分生，細(xì)胞受感染的程度也大，這時(shí)除了培養(yǎng)基中可見(jiàn)外，細(xì)胞表面通常也象長(zhǎng)滿(mǎn)了粉刺，所以有人認(rèn)為細(xì)胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲(chóng)的生長(zhǎng)。據(jù)說(shuō)，中國(guó)病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲(chóng)，似乎和草履蟲(chóng)和變形蟲(chóng)有類(lèi)似之處，然而由于課題經(jīng)費(fèi)不夠而不能繼續(xù)進(jìn)行下去。由此黑膠蟲(chóng)屬于原蟲(chóng)的有比較大的可能性。

三、關(guān)于黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)的幾種情況

1、“黑膠蟲(chóng)”的出現(xiàn)常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn)并使實(shí)驗(yàn)中斷，尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡。就是在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良時(shí)，黑膠蟲(chóng)容易出現(xiàn)。“黑膠蟲(chóng)”生長(zhǎng)與細(xì)胞的生長(zhǎng)有此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，即當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)小黑點(diǎn)會(huì)相應(yīng)的減少；反之則增加，似乎有細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)的關(guān)系，但總的來(lái)說(shuō)它的出現(xiàn)似乎并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2、細(xì)胞剛用的時(shí)候，觀察均生長(zhǎng)良好，密度適中，培養(yǎng)液清亮，小黑點(diǎn)一般不出現(xiàn)，但是對(duì)細(xì)胞傳代以后就陸續(xù)出現(xiàn)多少不等的小黑點(diǎn)，有時(shí)候在一夜之間暴長(zhǎng)。細(xì)胞進(jìn)過(guò)多次傳代的情況下，也會(huì)使黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)。

3、換用了其他公司的血清，多是北方公司的血清，就出現(xiàn)了這種非常類(lèi)似這里的”黑膠蟲(chóng)“的情況。在北京醫(yī)科大學(xué)/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社出版的《現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究方法與技術(shù) 》書(shū)中關(guān)于檢查血清中寫(xiě)道，“我國(guó)北方小牛血清還多見(jiàn)黑膠蟲(chóng)污染”。其實(shí)在很多，遭遇黑膠蟲(chóng)的案例中，大部分細(xì)胞培養(yǎng)者都認(rèn)為黑膠蟲(chóng)來(lái)源于血清。

四、關(guān)于再細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑膠蟲(chóng)后的幾種處理建議

1、換好一點(diǎn)的血清，當(dāng)然是進(jìn)口胎牛血清（國(guó)產(chǎn)血清太臟），就是價(jià)格高的離譜，經(jīng)濟(jì)條件不允許，可以用進(jìn)口新生牛血清代替。建議如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必滅活，這樣可以有效減少“小黑點(diǎn)”的形成。一般的血清都不要去滅活處理，為什么呢？INVITROGEN公司在其血清說(shuō)明書(shū)上解析道：經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或*沒(méi)有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱滅活的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。除非是在做免疫學(xué)研究或培養(yǎng)干細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，才推薦做熱滅活。所以在不是做免疫學(xué)研究或培養(yǎng)干細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，血清盡量不經(jīng)熱滅活。

2、如果是貼壁細(xì)胞的話，可用無(wú)菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，就不太好處理拉，可以向其中少加一點(diǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞。加滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)有黑膠蟲(chóng)的剛復(fù)蘇的細(xì)胞很有效！還有就是實(shí)驗(yàn)環(huán)境要注意好，保持細(xì)胞間整個(gè)環(huán)境的潔凈度。如果細(xì)胞不是非常珍貴，可以用伯氨奎、磺胺、四環(huán)素、貝尼爾，也有建議慶大霉素500ug/ml洗滌。

3、換用進(jìn)口的一次性塑料培養(yǎng)瓶。

4、停止復(fù)蘇，停止養(yǎng)細(xì)胞，*消毒所有用于細(xì)胞培養(yǎng)的一切用品，包括所用的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基，吸管，胰酶，孵箱，超凈臺(tái)、空間等等你能想到的和細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的所有物品。一個(gè)星期后，再?gòu)?fù)蘇污染之前凍存的細(xì)胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。這樣你可能覺(jué)得動(dòng)作太大，但可以用一個(gè)星期的時(shí)間挽救兩個(gè)月的時(shí)間，還有其他你為了找到污染源，去除污染所耗費(fèi)的精力，和財(cái)力。

5、在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打，沖洗干凈后再加入培養(yǎng)液，堅(jiān)持天天洗，傳代時(shí)加生理鹽水再離心一次，接種密度稍大一些，一段時(shí)間后，蟲(chóng)子就會(huì)大大減少，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也不會(huì)有大的影響。所有東西重配；如果實(shí)在要搶救，重點(diǎn)突破，留幾瓶污染不是很?chē)?yán)重的細(xì)胞搶救，其余棄去

6、如果有其它可用的細(xì)胞，那么污染的細(xì)胞扔掉；如沒(méi)有，可試著用抗生素，zui可靠的是細(xì)菌培養(yǎng)加藥敏，據(jù)藥敏結(jié)果選擇抗生素，當(dāng)然不能影響到細(xì)胞的狀態(tài)。

7、有材料稱(chēng)minocycline具有一定的作用，可以和換液結(jié)合起來(lái)使用。由于黑膠蟲(chóng)尚未明確鑒定出是什么生物，所以上述的處理方法不一定正確，可以供考慮采用。

8、有人為尋找到殺滅“黑膠蟲(chóng)”的方法，做了一個(gè)試驗(yàn)，他取有“黑膠蟲(chóng)”污染的六孔板，每孔內(nèi)有2ml培養(yǎng)液，向有污染的孔內(nèi)分別加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新潔爾滅原液，邊加邊在倒置顯微鏡下觀察。zui后他得出結(jié)論：新潔爾滅與水或培養(yǎng)基的比例為1：4時(shí)即可殺死“黑膠蟲(chóng)”。但是新潔爾滅對(duì)細(xì)胞的負(fù)面影響太大，比較珍貴的細(xì)胞培養(yǎng)不采用此方法。

五、國(guó)外關(guān)于黑膠蟲(chóng)的相關(guān)情況

在國(guó)外的生物論壇上也有很多人在討論black dots 和black particles，也就是我們所說(shuō)的黑膠蟲(chóng)。他們所描述black dots 和black particles的情況，基本上和國(guó)內(nèi)論壇上相似。國(guó)外有人用實(shí)驗(yàn)證明black dots 或black particles 不是支原體，而在細(xì)菌范圍內(nèi)。基本過(guò)程如下：If the poster is concerned about mycoplasma, there are tests to identify them. One is a Hoechst dye staining technique to look for extranuclear DNA spots.Also, prepare a dry flame-fixed smear from another aliquot of the media (5-10 ul) and stain with crystal violet. See under microscope at high magnification if there is anything resembling bacteria. And by the way, estimate the size of the particles to be sure it is in the range of bacteria.

六、總結(jié)

從前面關(guān)于黒膠蟲(chóng)的描述可以看出，人們遇到的黒膠蟲(chóng)并不都是一樣的，有象細(xì)菌的、有象支原體的、有象原蟲(chóng)的、有象真菌的，還有象細(xì)胞碎片的。在國(guó)內(nèi)個(gè)實(shí)驗(yàn)室的器材條件參差不齊，而且實(shí)驗(yàn)人員的操作質(zhì)量也不盡相同，同一種現(xiàn)象也可能有些許差異，當(dāng)用描述出來(lái)的現(xiàn)象的差異可能變大也可能變小。所以很多人看到細(xì)胞被細(xì)菌污染了，不好處理，而卻描述出來(lái)的現(xiàn)象和流傳的黑膠蟲(chóng)類(lèi)似，就會(huì)把培養(yǎng)失敗的原因歸結(jié)到的黒膠蟲(chóng)污染，甚至可能說(shuō)它發(fā)現(xiàn)的是真正的黑膠蟲(chóng)。這樣的事情多了，黑膠蟲(chóng)就會(huì)人為的變種，象什么的都有。黑膠蟲(chóng)是否存在，還有待于科學(xué)的發(fā)展。但有一點(diǎn)可以肯定的，大部分人發(fā)現(xiàn)的“黒膠蟲(chóng)”并不是真正那個(gè)未知的黒膠蟲(chóng)，而是不很常見(jiàn)的細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)等微生物污染。