亞“G1 ”峰方法簡便，但只是代表G0 /G1 期發生凋亡的細胞，S期和G2 期細胞凋亡發生于G1 峰后，無法觀察。此外，由于全部細胞均經固定，因此不能區別死細胞和活細胞。Hoechst-PI染色則可彌補上述不足。Hoechst 33258 可被活細胞攝取，與DNA結合在紫外光下呈藍色熒光。繼而PI使死細胞著染產生紅色熒光。因此在細胞二維直方圖上根據紅藍兩種熒光可分辨三種細胞：正常活細胞對染料有拒染性，藍色和紅色熒光均較少；凋亡細胞有膜通透性改變，主要攝取Hoechst染料，表現為強藍色熒光，弱紅色熒光；壞死細胞由于有很強的PI嗜染性并可覆蓋Hoechest染色，故呈弱藍色強紅色熒光。

【材料及試劑】

（1）碘化丙啶（PI）貯存液：100mg/ml，4℃避光保存。

（2）Hoechst 33258貯存液：100mg/ml，4℃避光保存。

（3）0.01mol/L PBS pH 7.0~7.2

【操作步驟】

（1）常規制備單細胞懸液；

（2）加入Hoechst 33258 溶液，使其終濃度為1mg/ml，37 ℃水溶，7分鐘；

（3）冰上冷卻， 離心棄染液， PBS重懸；

（4）加入PI染液，使其終濃度為5mg/ml，冰浴；

（5）離心棄染液，PBS洗一次，進行流式細胞儀進行分析，、直外激光檢測記錄400~500nm處藍色熒光和大于630nm處紅色熒光；

【結果判斷】

正常對照細胞呈弱藍色及弱紅色熒光；凋亡細胞呈藍色及弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色及弱藍色。