細胞培養基本條件

1、合適的細胞培養基

合適的細胞培養基是體外細胞生長增殖的zui重要的條件之一，培養基不僅提供細胞營養和促使細胞生長增殖的基礎物質，而且還提供培養細胞生長和繁殖的生存環境。

2、血清

目前，大多數合成培養基都需要添加血清。血清是細胞培養液中zui重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養成分。

3、無菌無毒細胞培養環境

無菌無毒的操作環境和培養環境是保證細胞在體外培養成功的首要條件。在體外培養的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質污染，或者自身代謝物質積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養細胞時，必須保持細胞生存環境無菌無毒，及時清除細胞代謝產物。

4、恒定的細胞生長溫度

維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。

5、合適的氣體環境

氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。

細胞培養基種類與基本成分

細胞培養基的種類很多，按其來源分為合成培養基和天然培養基（目前使用的培養基絕大部分是合成培養基），按其物質狀態分為干粉培養基和液體培養基兩類。干粉培養基需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養基由專業商家提供，用戶可直接使用，非常方便。

1、合成培養基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質：

氨基酸

氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養液內。已含谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2 周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。

碳水化合物

碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。

無機鹽

培養液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調節細胞膜功能。培養液的滲透壓是一個非常重要的因素, 細胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。標準培養液的滲透壓在此范圍內波動。特別注意：向培養液中加入其它物質有可能會明顯改變培養液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質。向培養液中添加HEPES 時需按以下方法調節鈉離子濃度。

緩沖系統

大多數細胞所需pH 在 7.2 - 7.4。但是，細胞培養zui適pH 值隨培養的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉化細胞系則需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
 

由于多數培養液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2 體系進行緩沖，因此，氣相中的CO2 濃度應與培養液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養箱空氣中CO2 濃度設定在5％，培養液中NaHCO3 的加入量為1.97g/L；如果CO2 濃度維持在10％，培養液中NaHCO3 的加入量為3.95g/L。

細胞培養瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES 是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養條件下，細胞培養瓶的蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數培養液中含有酚紅作為pH 指示劑，酸性培養液呈橙黃色，堿性培養液呈深紅色。

維生素

在細胞培養中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長。

其它成分

在一些較為復雜的培養液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術中常用的DMEM 培養液，2-Me 對細胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養細胞的損害。另一個重要作用是促進分裂原的反應和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用，已廣泛應用于雜交瘤技術，另外，也開始用于一些難以培養的細胞。2-Me 是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.13，純的2-Me 是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M 的儲存液，用時每升培養液加0.5ml。

液體培養基保存：

液體培養基應于4℃冰箱避光保存，實驗前放入37℃預熱。未加血清液體培養基有效期為12 個月。液體培養基中的L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果細胞生長不良，可以再添加適量L-谷氨酰胺。

干粉培養基保存：

4℃冰箱避光保存，有效期36 個月。

血清

細胞培養液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是zui常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質，其質量明顯不如前兩種。

血清的質量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質。因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，然后再大量購買質量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：

（1）需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切勿超過1 個月。由于血清結冰時體積會增加約10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一定體積空間，否則易發生污染或玻璃瓶凍裂。

（2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發現血清有懸浮物，則可將血清加入培養液內一起過濾，切勿直接過濾血清。

（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發生。切勿直接將血清從-20℃進入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝集而出現沉淀。

（4）熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已*解凍的血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質量。補體參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化。

（5）切勿將血清在37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會而影響血清質量。

（6）血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。

顯微鏡下“小黑點”：經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清。
 

細胞培養環境

1、實驗室設計

細胞培養是一種無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養于一室，而洗刷消毒在另一室。

2、常用設施及設備

（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側流式、直流式和外流式三大類。

（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。

（3）操作間：普通培養箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物

（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

（5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。

3、培養器皿

常用細胞培養器皿有培養瓶、培養板、培養皿等。常準備量是使用量的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、利于細胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。

（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養液、血清等液體，常用規格有500ml、250ml、100ml 等幾種。

（2）培養瓶：根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異，用于細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內任何部位，規格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等幾種。

（3）培養皿：用于開放式培養及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm 等幾種。

（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用1ml 和10ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。

（5）離心管：離心管是細胞培養中使用zui廣泛的器皿，根據用途不同形態各樣，常用于細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml 和5ml。

（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

4、細胞培養溫度

維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細胞對培養溫度要求也不同。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1 小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-41℃1 小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41-42℃1 小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1 小時，細胞全部死亡。相反，溫度不低于0℃時，對細胞代謝雖有影響，但并無傷害作用；把細胞放入25－35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在4℃數小時后，再回到37℃培養，細胞仍能繼續生長。細胞代謝隨溫度降低而減慢。當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是，如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如－80℃或－196℃（液氮）長期保存。

5、合適的氣體環境

氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。

開放培養時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的pH 值。大多數細胞的適宜pH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環境中更利于細胞生長。但有一些細胞也喜歡偏堿環境中生長，如成纖維細胞pH 是7.4-7.6。每種細胞都有其zui適pH 值。
 

細胞培養無菌操作基本技術

無菌操作技術分為三個部分：工作環境及表面的處理，細胞培養所用玻璃及塑料制品的處理及培養液與培養細胞的處理。

工作環境的處理

使用層流超凈工作臺是有效的手段。超凈工作臺正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超凈臺。

（1）實驗前，無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風機運轉10 分鐘后，才可開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。實驗結束后，將實驗物品帶出工作臺。如需要繼續進行下一個實驗，則用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風機運轉10 分鐘后，才可進行下一個實驗操作。

（2）無菌操作工作區域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通。實驗用品要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在操作臺中央無菌區域內進行，勿在邊緣非無菌區域操作。

（3）小心取出無菌實驗用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。

（4）工作人員應注意自身的安全，必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心，并選擇適當等級的無菌操作臺（至少兩級）。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳物品傷人等。

（5）定期檢查下列項目：CO2 鋼瓶內的CO2 壓力；CO2 培養箱內的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染；無菌操作臺內氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA 過濾器濾膜，預濾網﹙300 小時/預濾網，3000 小時/HEPA）。

細胞培養所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒

清洗

在組織細胞培養中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養成分的化學物質，均能影響培養細胞的生長。因此對新使用玻璃器皿和重新使用的培養器皿都要嚴格*的清洗，且要根據器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

組織細胞培養中，使用量zui大的是玻璃器皿，故工作zuizui大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質。

（1）浸泡：初次使用和培養使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡一夜，以中和其中的堿性物質。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求*浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。

（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。清潔液去污能力很強。是清洗過程中關鍵的一環。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為一夜，不應少于6 小時。 清潔液可根據需要，配制成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g） 濃
 

硫酸（ml） 蒸餾水（ml） 比例如下
（A）強清潔液 63∶1000∶200000

（B）次強清洗液 120∶200∶1000

（C）弱清潔液 100∶100∶100。

清潔液配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。

（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用。

膠塞的清洗

細胞培養中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先用自來水沖洗，再做常規處理，常規清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘，以除掉培養中的蛋白質。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30 分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20 分鐘，晾干備用。

塑料制品的清洗

塑料自制品現多是采用無毒并已經特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2% NaOH 浸泡一夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，zui后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

消毒

細胞培養的zui大危險是發生培養物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養器皿和培養液消毒不合格或不*。由于有關培養的每個環節的失誤均能導致培養失敗，故細胞培養的每個環節都應嚴格遵守操作常規，防止發生污染。

消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學滅菌法（各種化學消毒劑）和抗生素。

（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養室紫外線燈應距地面不超過2.5 米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外線可產生臭氧，污染空氣，試劑及培養液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射。

（2）溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用zui廣泛、效果的消毒方法。溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內氣體阻塞而千百萬危險，保證其內氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。

消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發生。

常用物品消毒壓力及時間：

培養液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃, 15 磅, 20 分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干熱滅菌170℃, 4 小時。

（3）化學消毒法：zui常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學消毒法操作簡單、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培養用液滅菌或預防培養物污染