1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。

2.細胞培養：取待測培養細胞，制備成細胞懸液，按等量接種入多孔培養板中，培養6小時左右開始加藥。

3.制備篩選培養基：在100ug/ml~1000ug/ml范圍內確定幾個梯度，比如先做個100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養基稀釋G418制成篩選培養基。

4.加G418篩選：吸除培養孔中培養基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養基。

5.換液：根據培養基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養基。方法同4.

6.確定*篩選濃度：在篩選10~14天內能夠殺死所有細胞的zui小G418濃度即為*篩選濃度。在*輪就篩選出*G418濃度的可能性不大，zui有可能的是出現這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的 G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是400ug/ml不能殺死細胞，而800ug/ml在第5天就把所有細胞都殺死了，則可以再用500ug /ml、600ug/ml、700ug/ml進一步篩選，以確定*篩選濃度！心得：由于特性明確的細胞系G418的*用量還是比較穩定的，所以有時候不需要在這么大范圍內進行篩選。比如說你要轉染NIH3T3細胞，現在我告訴你我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml，這時你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個濃度進行篩選。

通過預實驗確定了*篩選濃度后，就可以做穩定轉染了。

a 轉染：轉染后培養24小時或者更長，到細胞增長接近匯合時按1:4密度傳代，繼續培養，待細胞密度增至50%~70%匯合時；

b 加G418：去掉培養液，PBS洗一次，加入按*篩選濃度配制好的G418篩選培養基。

c 換液：根據培養基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養基。當有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選10~14天后，可見有抗性的克隆出現，停藥培養，待其逐漸增大后；

d 挑單克隆：制備細胞懸液，細胞計數，用培養基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉入到48孔中增殖。

e 單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總RNA,做RT-PCR檢測目的基因是否存在。