混合膠質細胞培養來源于1-2天的大鼠，如同星形膠質細胞培養，有輕微的改動。乳鼠斷頭后大腦收集在DMEM-Ham‘s F-12含有1%抗菌素的溶液中。除去腦膜，血管和白質后，用機械勻漿法將大腦皮層勻漿，然后將細胞懸液依次通過230μm和104μm孔徑的鋼網過濾，然后用離心法收集細胞，用小膠質細胞條件培養基重懸細胞。條件培養基的成分：DMEM-Ham’s F-12培養基，添加2mM L-谷氨酸，1mM 丙酮酸鈉，1×非必須氨基酸，10%胎牛血清和0.5%雙抗溶液。然后接種到培養皿中。

小膠質細胞的分離：混合膠質細胞培養21天后，小膠質細胞通過輕微的胰蛋白酶化作用得到。胰蛋白酶1:3溶解于DMEM-Ham`s F-12 45-60分鐘。胰蛋白酶化作用導致上層含所有膠質細胞的細胞層解析，而小膠質細胞仍然吸附在培養皿的底層。含有上層裂解細胞的培養基用氣體吹掉，換入新的小膠質細胞條件培養基。胰蛋白酶化作用24小時后，分離出來的細胞可用作毒性分析。