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基因組DNA提取

來源:北京索萊寶科技有限公司   2014年11月20日 08:46  

基因組DNA提取試劑盒簡介:

DNA是遺傳信息的載體,是重要的生物信息分子,是分子生物學研究的主要對象,為了進行測序、雜交、基因表達、文庫構(gòu)建等試驗,獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提,因此基因組DNA的提取也是分子生物學試驗技術(shù)中提取試劑盒,如植物、動物、細菌、細胞、血液、酵母等基因組DNA提取試劑盒。所提取的基因組純度高,片段大小在50kb左右。用戶可根據(jù)需要選用不同的試劑盒來進行不同樣品的抽提。
基因組DNA提取的原則:
1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性(因為遺傳信息全部儲存在核酸一級結(jié)構(gòu)中,故完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ))。
2、排除其它分子(如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、有機溶劑等)的污染,使下游試驗順利進行。基因組DNA提取的原理和方法:DNA與組蛋白構(gòu)成核小體,核小體纏繞成中空的螺旋管狀結(jié)構(gòu),即染色絲,染色絲再與許多非組蛋白形成染色體。染色體存在于細胞核中,外有核膜及胞膜。從組織中提取DNA必須先將組織分散成單個細胞,然后破碎胞膜及核膜,使染色體釋放出來,同時去除與DNA結(jié)合的組蛋白及非組蛋白。
1、樣品預處理
從各種不同來源的樣品(如細菌、酵母、血液、動植物組織細胞等)中提取高純度的基因組DNA,因細胞結(jié)構(gòu)及其成分不同,樣品預處理方式也不同,以下簡單介紹常用提取材料的預處理方式,若需詳細了解,請參考本公司各試劑盒說明書。
部分樣品預處理方式:
植物材料  液氮研磨

動物材料   勻漿、液氮研磨

培養(yǎng)細胞   蛋白酶K處理
細菌      溶菌酶破壁
酵母      破壁酶破壁、玻璃珠研磨
血液      紅細胞裂解液去紅

2、細胞裂解
CTAB法:適用于植物組織、真菌等。
CTAB是一種陽離子去污劑,可溶解細胞膜,并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中(>0.7M NaCl)是可溶的,通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核
酸分離出來。
SDS法:適用于細菌、血液、酵母、動物組織、細胞等。SDS是一種陰離子去污劑,可溶解細胞膜,裂解細胞,使蛋白質(zhì)變性、染色體解體。

其它裂解方法:
物理方式:機械剪切、超聲波破碎、研磨勻漿等
化學方式:異硫氰酸胍、堿裂解等
酶法:蛋白酶K

3、DNA分離純化
純化要求:核酸樣品中不應存在對酶(如核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、多酚和脂類分子等污染應降低到低程度。排除其它核酸分子的污染,
如提DNA時應去除RNA,反之亦然。
純化方法:細胞破碎后,常使用吸附材料結(jié)合方法去除雜質(zhì)和純化DNA,主要有硅基質(zhì)材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。因硅基質(zhì)材料可特異吸附核酸DNA,使用方便、快捷,不需要使用有毒溶劑如酚、氯仿等,使得提取基因組像過濾一樣簡單,因此硅基質(zhì)材料成為大規(guī)模分離純化DNA的通用方法。硅基質(zhì)材料吸附核酸的原理:主要利用DNA在高鹽低pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料相結(jié)合,在低鹽高pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料脫離的特征。其機理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質(zhì)水分子結(jié)構(gòu),形成陽離子橋,當鹽被清除后,再水化的硅石破壞了基質(zhì)和DNA之間的吸引力,因而DNA從硅基質(zhì)上被洗脫下來。
注意事項:盡量簡化操作步驟,縮短提取過程,以減少各種有害因素對核酸的破壞。

減少化學物質(zhì)對DNA的降解,為避免過酸、過堿對DNA雙鏈中磷酸二酯鍵的破壞,操作多在pH值4.0-10.0的條件下進行。防止基因組DNA的生物降解,主要是DNase降解基因組DNA,DNase需二價金屬陽離子如Mg2+等的激活,可用EDTA等金屬離子螯和劑螯和Mg2+以抑制DNase的活性。減少物理因素對DNA的降解,物理降解因素主要包括機械剪切力(如劇烈振蕩、攪拌等),細胞突然置于低滲液中導致的細胞爆炸式破裂,DNase大量釋放,樣品反復凍融和高溫等。

4、DNA洗脫收集
DNA的洗脫效率取決于以下重要因素:
洗脫液成分:采用硅基質(zhì)膜吸附的DNA,可將DNA在低鹽高pH值條件下洗脫下來。pH值在7.0-8.5之間洗脫效率較高,pH值低于7.0則洗脫效率很低。一般基因組提取試劑盒中的洗脫緩沖液TE(pH8.0),既為DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫下來提供良好的pH環(huán)境,其中的EDTA又能保證DNA不被DNase降解,同時由于EDTA濃度非常低,對核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶的影響非常微弱,不影響后續(xù)實驗,可放心使用。
洗脫液體積:當洗脫液體積小于30ul時,洗脫效率很低且不穩(wěn)定;當洗脫液體積在50-200ul時,洗脫效率穩(wěn)定在80-90﹪,并可保證得到大產(chǎn)量,因此洗脫液體積不能小于30ul。

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