、組織塊——酒精浸泡——剪碎——Hank's沖洗——胰酶消化——離心——Hank's沖洗——離心——計數——轉至培養瓶——37℃培養——接種。

2、組織塊——酒精浸泡——剪碎——轉至培養瓶——加培養液——37℃培養——接種。

具體操作步驟：

一、材料及試劑：

儀器：培養箱(調整至37℃)，培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱(37℃)。

材料：小鼠c26結腸癌和lewis肺癌組織塊。

試劑：1640培養基(含20%小牛血清)，0.25%胰酶，Hank's液，碘酒。

二、操作步驟：

(一)胰酶消化法：

1、器材：將小鼠c26結腸癌和lewis肺癌組織塊置75%酒精泡2-3秒鐘。

2、用Hank's液洗滌三次。

3、用手術剪將組織剪成小塊(1mm2)，再用Hank's液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。

4、視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。

5、加入3-5ml培養液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。

6、靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。

8、加入Hank's液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。

9、加入培養液l-2ml(視細胞量)，血球計數板計數。

10、將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25ml細胞培養瓶中，37℃下培養。

上述消化分離的方法是zui基本的方法，在該方法的基礎上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同(如膠原酶，透明質酶等)。

(二)組織塊直接培養法：

自上方法第3步后，將組織塊轉移到培養瓶，貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上，將培養液加至瓶中，培養液勿接觸組織塊。入37℃靜置3-5小時，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中(勿使組織漂起)，37℃繼續培養。

四、注意事項：

1、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

2、在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。

3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

五、無菌操作的幾個注意事項：

1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。

附：Hank's液配方：

KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存。