A549細胞的培養

A549細胞為人肺腺癌細胞，屬于傳代細胞系，可穩定地傳代培養。一般用胰酶消化后，加入生長液稀釋，以1：2～1：3傳代培養都是可行的。

一、 [所需溶液]

1. 細胞沖洗液：磷酸鹽緩沖液(PBS)——無Ca、Mg

NACL                  8.00g；

KCL                   0.20g;

KH₂PO₄                    0.20g;

Na₂HPO_{4 .。}12H₂O       1.15g

加水至 1 000mL,將PH調至7.4，高壓滅菌。

1. 消化液

1. 胰酶-PBS

結晶胰酶                      2.5g;

高壓滅菌后的PBS              1000ml

用磁力攪拌器攪拌均勻，使其*溶解，通過0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝備用，放置—20℃保存。

1. 胰酶—EDTA:

結晶胰酶                      0.5g;

EDTA鹽溶液                    0.2g

無Ca、Mg PBS                  1 000ml

用磁力攪拌器攪拌均勻，使其*溶解，通過0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝備用，放置—20℃保存。

1. 細胞培養液：RPMI 1640培養液

配制方法：

1. 將一袋干粉型RPMI 1640培養基溶于900ml三蒸水中，沖洗包裝袋兩至三次倒入培養液中。
2. 加入丙酮酸鈉 0.1g，NaHCO₂ 2g以及雙抗，加入磁力攪棒并置于磁力攪拌器上充分攪拌。雙抗的配置濃度為 100U/ML 青霉素和100U/ML鏈霉素。(一般市售的青霉素為80 萬 U/瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養液中加入0.5ml；市售的鏈霉素為100 萬 U/瓶，將其溶解于5ml三蒸水中，每升培養液中加入0.5ml)。
3. 調整培養液的ＰＨ值，用ＰＨ精密試紙觀察　ＰＨ７.２～７.４即可。
4. 過濾法除菌，所使用的濾器為Ｏ_２加壓過濾，０.２２μｍ濾膜，濾膜事先采用高壓滅菌消毒。
5. 分裝，加蓋瓶塞，加封紗布報紙，用繩固定，放置—20℃保存。

二、［細胞的維持和培養］

• 細胞的復蘇

• 準備一個盛有３７℃溫水的燒杯，從液氮罐中取出存有Ａ５４９細胞的凍存管，放于３７℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動使其迅速融化。
• 1000～２000 r，3～５min離心。
• 在無菌操作臺中采用75%的乙醇*擦拭凍存管，然后打開凍存管，注意動作要輕柔。
• 用1ml槍頭將上清液去除，加入1ml預熱的細胞培養液將細胞吹散開，轉移至25cm²培養瓶中。
• 補充4ml的RPMI 1640培養基，并且添加10%的胎牛血清。
• 倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO₂培養。
• 24h后，更換新的培養液。
• 常規傳代培養。

• A549細胞更換新的培養液

• 無菌操作打開培養瓶瓶蓋，倒掉培養液。
• 用PBS反復沖洗細胞2～3遍。
• 加入新鮮的預熱好的培養液及10%的胎牛血清。

各種液體需要量（ml）

• 倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO₂培養。

• A549細胞的傳代

• 無菌操作打開培養瓶瓶蓋，倒掉培養液。
• 向已經長滿的細胞中加入消化液1ml，輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有的細胞表面，吸棄或倒掉，輕輕沖洗細胞表面2～３遍，以盡可能去除原培養液中的牛血清。
• 加入1ml消化液，在37℃培養箱中孵育5～８min后把培養瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發現細胞的胞質回縮、胞間質增大后，立即終止消化。
• 加入5ml預熱至37℃的培養液，用玻璃吸管反復吹打以分散細胞。吹打過程按順序進行，從培養瓶底部一邊開始到另一邊結束，以確保所有的底部都被吹到。
• 吸取一半的細胞懸液，接種到新的25cm²培養瓶中，補足培養液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液體量為5～10ml。
• 倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO₂培養。

注意事項：

• 所有液體在加入細胞瓶前均應預熱到37℃。所有液體均應調整PH至7.2左右，均不能超過7.4。
• 細胞消化傳代時吹打不要產生氣泡，吹打力量不宜過多，否則會損傷細胞。
• 嚴格執行無菌操作的要求。
• 盡可能減少消化液剩余量，過多時會對細胞產生損傷，可多添加些含牛血清的培養液中和。
• 培養瓶在室溫中放置時間應盡可能短。

• A549細胞的凍存

• 消化已生長融合的單層細胞。
• 用生長液懸浮細胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲基亞砜)。分裝在2ml容積的凍存管中。
• 用本實驗室自制的凍存包包裹好凍存管，放在-70℃冰箱中置放一夜。
• 放入液氮中凍存。