體外肝細(xì)胞損傷模型建立（CCl4和H2O2）

1 、 大鼠肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

大鼠4％戊巴比妥麻醉，門靜脈插管，先以無(wú)鈣灌流液灌流，繼以37℃通入O2的Ⅳ型膠原酶灌流液繼續(xù)循環(huán)灌流15 min。將肝臟移至一平皿內(nèi)，輕輕撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成單個(gè)肝細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，低速離心（500 r·min-1，1 min，4℃）棄上清，同法用清洗液反復(fù)洗3次。然后用*1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10％小牛血清，105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素和10 mg·L-1胰島素）制成1×109個(gè)·L-1肝細(xì)胞懸液。分離的肝細(xì)胞經(jīng)0.6％臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)得細(xì)胞活力大于90％，高碘酸雪夫反應(yīng)顯示糖原法鑒定99％為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

將上述肝細(xì)胞懸液分別加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培養(yǎng)板中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12～16 h后可見肝細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)板孔底上生長(zhǎng)。

2 、 CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性損傷模型的建立

肝細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，吸棄上清，更換培養(yǎng)液并加入不同濃度的CCl4〔（1～16 mmol·L-1），以少量的二甲亞砜助溶，二甲亞砜終濃度為0.1％（體積分?jǐn)?shù)）〕，作用不同時(shí)間（1～12 h）后，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測(cè)AST，以及肝細(xì)胞的MDA含量和GSHpx活性；同步測(cè)定96孔板中培養(yǎng)肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制備CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的量效和時(shí)效曲線。選擇zui造損傷濃度和損傷時(shí)間制備肝細(xì)胞的損傷模型，同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組，每組至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

3 、 H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性損傷模型的建立

同法更換培養(yǎng)液，加入不同濃度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同時(shí)間（0.5～4 h）后，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測(cè)ALT，測(cè)定肝細(xì)胞的MDA含量；同步測(cè)定96孔板中培養(yǎng)肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制備H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的量效和時(shí)效曲線，選擇zui適損傷濃度和損傷時(shí)間制備肝細(xì)胞的損傷模型，同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組，每組至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

4 、 檢測(cè)指標(biāo)

(1)AST、ALT的測(cè)定 培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)離心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定上清液中AST和(或)ALT活性，結(jié)果以U·(106 cell)-1表示。

(2)肝細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用MTT比色法。

(3)肝細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHpx）活性的測(cè)定 先制備GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混勻，2 min后，離心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝細(xì)胞樣品）0.4 ml，另設(shè)樣品空白管，非酶反應(yīng)管和試劑空白管，加入各種試劑。混勻后立即計(jì)時(shí)，靜置12 min后，以樣品空白管調(diào)零點(diǎn)，于423 nm波長(zhǎng)處讀得吸光度（A）值。在GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的GSH波度。GSHpx酶活力單位是在37℃，pH6.5條件下，每106個(gè)肝細(xì)胞、每分鐘使GSH濃度下降1 μmol為1個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式為：GSHpx活力單位=（［GSH］非酶管-［GSH］樣品管-［GSH］試劑空白管）/3。結(jié)果以U·(106 cell)-1表示。

(4) 肝細(xì)胞丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 先制備MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入生理鹽水1 ml，混勻，移入離心管中，離心（2 500 r·min-1，10 min），棄上清，加15％ TCA 2 ml，破壞細(xì)胞并沉淀蛋白質(zhì)，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加熱30 min。根據(jù)樣本的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的濃度，結(jié)果以 nmol·(106 cell)-1表示。

5 、 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。兩變量間相互關(guān)系，采用直線相關(guān)和回歸分析。