基本原理：本文分離單核細(xì)胞所用方法是Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，主要是根據(jù)不同細(xì)胞間密度的差別進(jìn)行細(xì)胞分離。此法易操作，且使用通常的實(shí)驗(yàn)設(shè)備即可完成。

試劑與器材

·外周血單個(gè)核細(xì)胞

·PBS 1×和PBS 10×（無Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA

·胎牛血清（56℃，30分鐘加熱滅活）

·HCl 1mol/l

·Percoll分層液（密度=1.130g/ml,商品）

·4g/L臺盼藍(lán)染液（溶解在PBS液中）

·50ml聚丙烯圓錐管·毛細(xì)吸管

·移液管（1、2、10ml）

·CO2孵箱

·超凈臺

·有旋轉(zhuǎn)桶轉(zhuǎn)子裝置的離心機(jī)

·PH計(jì)

操作步驟：所有的操作應(yīng)該在無菌條件下進(jìn)行

（一）不同密度Percoll分層液的配制

1.Percoll分層液儲備液的制備：取未稀釋的Percoll原液（從瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（無Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.4

2. Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll儲備液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（無Ca2+ Mg2+）3. Percoll分層液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

（二）不連續(xù)密度梯度制備

1. 將洗滌過的8×107外周血單個(gè)核細(xì)胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘（慢慢增加速度，無制動停轉(zhuǎn)）。

（三）單核細(xì)胞的分離

1. 離心后單核細(xì)胞存在于Percoll分層液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度較小的部分）之間的界面中。

2. 用毛細(xì)吸管仔細(xì)收集單核細(xì)胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗滌細(xì)胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

4. 若需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中。

5. 用臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果：本法回收的細(xì)胞中單核細(xì)胞占70-100%（存活率應(yīng)大于90%），淋巴細(xì)胞占0-20%，粒細(xì)胞占0-5%，紅細(xì)胞占0-7%，血小板小于0.5%。3. Percoll分層液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

（二）不連續(xù)密度梯度制備

1. 將洗滌過的8×107外周血單個(gè)核細(xì)胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘（慢慢增加速度，無制動停轉(zhuǎn)）。

（三）單核細(xì)胞的分離

1. 離心后單核細(xì)胞存在于Percoll分層液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度較小的部分）之間的界面中。

2. 用毛細(xì)吸管仔細(xì)收集單核細(xì)胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗滌細(xì)胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

4. 若需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中。

5. 用臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果：本法回收的細(xì)胞中單核細(xì)胞占70-100%（存活率應(yīng)大于90%），淋巴細(xì)胞占0-20%，粒細(xì)胞占0-5%，紅細(xì)胞占0-7%，血小板小于0.5%。3. Percoll分層液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（無Ca2+、Mg2+）

（二）不連續(xù)密度梯度制備

1. 將洗滌過的8×107外周血單個(gè)核細(xì)胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘（慢慢增加速度，無制動停轉(zhuǎn)）。

（三）單核細(xì)胞的分離

1. 離心后單核細(xì)胞存在于Percoll分層液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度較小的部分）之間的界面中。

2. 用毛細(xì)吸管仔細(xì)收集單核細(xì)胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗滌細(xì)胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

4. 若需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中。

5. 用臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果：本法回收的細(xì)胞中單核細(xì)胞占70-100%（存活率應(yīng)大于90%），淋巴細(xì)胞占0-20%，粒細(xì)胞占0-5%，紅細(xì)胞占0-7%，血小板小于0.5%。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

1.為了得到較好的結(jié)果，外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后應(yīng)立即使用。

2.所有操作過程應(yīng)在18-20℃中進(jìn)行。

3.仔細(xì)覆蓋各種Percoll分層液，避免破壞其界面。

4.洗滌分離細(xì)胞3次，以除去殘存的Percoll分層液和血小板。

5.如果所制備的細(xì)胞仍不純，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠， 以除去殘存的NK、T、B淋巴細(xì)胞。