成纖維細胞培養

（一）  原代培養

1、在手術室無菌條件下，切取新鮮的皮膚，增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩組織，修除表皮和皮下組織，鹽水反復沖洗后放入含PS的DMEM培養液內帶回無菌工作間。

2、把組織塊置于培養皿內，Hank,s液漂洗三遍后吸凈Hank,s液，眼科剪反復剪切組織塊成0.5－1mm3大小。用彎頭吸管吸取組織塊接種于40ml培養方瓶瓶壁上，組織塊間留約0.3－0.5cm的間距。

3、 塞好瓶塞，放入37℃電熱恒溫培養箱內3.5小時使培養的組織小塊微干涸。

4、從溫箱中取出培養瓶，向瓶底輕輕注入含20%CS及PS的DMEM培養液5ml，然后緩緩翻轉培養瓶，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶壁上的組織小塊，置于37℃溫箱內培養。

5、一周后取出培養瓶，棄去瓶內培養液，Hank,s液漂洗兩次后加相同的培養液5ml繼續培養。以后待細胞萌出后，同樣方法每周換液兩次。

（二）傳代培養

待原代培養細胞生長基本融合成片時即可傳代。

1、吸出培養瓶內的培養液，Hank,s液漂洗兩次，向瓶內加入0.5%的胰蛋白酶溶液少許以覆蓋瓶底為度。

2、大約1分鐘左右，鏡下觀察細胞胞質回縮，細胞間隙增大時立即吸出胰蛋白酶液，加入DMEM培養液終止消化。

3、用吸管吸取培養液輕輕反復吹打瓶壁細胞使之脫落形成細胞懸液，按1：3比例分裝傳代，加入足量的DMEM培養液后置于37℃恒溫培養箱內培養。

4、每周換液兩次，待細胞融合成單層再次傳代。本實驗均在第4－8代進行。