在許多研究中,需要將PCR產物克隆,以獲得目的dna片段。此時,所用PCR循環數應盡量小,以減少平臺效應或非特異性擴增產物的干擾。通常將PCR產物插入到載體中有下列一些方法。

1. 平末端連接：由于Taq dna聚合酶往往在PCR產物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補平末端。

2. 在PCR產物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A優先聚合,所以PCR產物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點,可以經限制酶切割產生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產物末端互補并進行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團可與PCR產物的3'端OH連接,連接產物在載體和PCR產物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA仍可轉化合適的受體菌,并在細菌體內修復.目前一些公司已開發出可直接用于克隆PCR產物的帶3'-T的T-Vector。

3. 粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點,直接將PCR產物經適當的限制酶切割后產生粘性末端,與載體連接,產生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經酶切后定向克隆到載體中。

第二節 材料、設備及試劑

一、材料

不同來源的模板DNA。

二、設備

移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機。

三、試劑：

1、10×pcr反應緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。

2、MgCl2 ：25mmol/L。

3、4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。

4、Taq DNA聚合酶5U/μl。

5、T4 DNA連接酶及連接緩沖液：配方見第五章。

6、經SmaⅠ酶切和加dT的pUC質粒。

7、其它試劑：礦物油(石蠟油)，1% 瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇和70% 乙醇。

第三節 操作步驟

一、PCR反應

1. 依次混勻下列試劑

35μl H2 O

5μl 10×PCR反應緩沖液

4μl 25mmol/L MgCl2

4μl 4種dNTP

0.5μl 上游引物(引物1)

0.5μl 下游引物(引物2)

0.5μl 模板DNA(約1ng)

混勻后離心5秒。

2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。

3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘, 72℃延伸2分鐘, 循環35輪,進行PCR。zui后一輪循環結束后, 于72℃下保溫10分鐘，使反應產物擴增充分。

二、電泳

按第二章所述,取10μl擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應產物及長度。

三、PCR產物的純化

擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產物純化。

(一)酚/氯仿法

1.取反應產物加100μl TE.。

2.加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000rpm離心15秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中. 這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。

3.再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次,每次回收上層水相。

4.在水相中加300μl 95%乙醇,置-20℃下30min沉淀。

5.在小離心機上10000rpm離心10min,吸凈上清液。加入1ml 70%乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。

(二)Wizard PCR DNA純化系統

Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。

該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化，試劑包括：

50ml Wizard PCR DNA純化樹脂

5ml 直接提取緩沖液

50支 Wizard微型柱

1、吸取PCR反應液水相放于1.5ml eppendorf管中。

2、加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。

3、加1ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內渦旋混合3次。

4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。

5、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 80%異丙 醇，對微型柱進行清洗。

6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。

7、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE或水，靜止1分鐘后，12000g離心20秒。

8、丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。

[注意] 1、純化樹脂在使用前必須充分混勻。

2、PCR產物中礦物油應盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產量。

四、載體加dT尾

1.將1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。

2.在小管中按上述PCR反應,加入各種混合物,除將4μl 4種dNTP改為4μl 25mM dTTP。

3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2h。

4.按前面三中所述,用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。

5.加入2倍體積 95%乙醇,在-20℃下沉淀1hr。

6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR產物與載體粘末端連接

1、在7ml PCR產物中加1ml帶dT尾的pUC質粒。

2、加1ml T4DNA連接酶，1ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接。

3、取5ml連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。

六、PCR產物3'突出端切平及平末端連接

1. 在50ml的PCR產物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混勻。

2. 37℃反應10分鐘后,70℃滅活10分鐘。

3. 用酚:氯仿抽提2次。

4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。

5. 質粒用Smal 切開后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1ml (約0.1mg)加入上述PCR產物中。加T4 DNA連接酶1ml ，連接緩沖液1ml 。

6. 取5ml 連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。

[注意]1.PCR非常靈敏, 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。

2.吸頭、離心管應高壓滅菌, 每次吸頭用畢應更換, 不要互相污染試劑。

3.加試劑前, 應短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。

4.應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。