1994年，Kim發明的TRAP由于具有靈敏度高等優點曾被廣泛應用于端粒酶的活性檢測中，不過安全性不夠，現在的端粒酶活性檢測實驗都在其基礎上進行了改良，更顯和人性化。以下是具體的實驗方法：

端粒是真核生物染色體末端的特異DNA-蛋白結構，端粒DNA是一系列重復的富含G的DNA序列，這一序列在生物進化中有高度的保守性(人重復序列為TTAGGG)。已確認端粒在保護基因組DNA不被降解、防止染色體有害的結合(如染色體末端融合、重排、染色體移位和染色體缺失)中起重要作用。

由于dna聚合酶不能復制線性DNA的zui末端，多數正常體細胞的端粒末端每經一個復制循環就進行性縮短。這一現象在體內和體外都得到證實，并且可能與真核生物的正常體細胞有限的繁殖能力有關。

這一活性可能在與細胞衰老有關的情況中起作用。與體細胞相對照，生殖細胞是永生性的，它需要為將來器官形成保存全部的遺傳信息。因此它必須對抗端粒縮短。這一工作通過在基因組染色體的末端添加新的端粒重復序列而完成。

端粒酶是一種核糖核蛋白，它們用自身的RNA成份的互補序列作模板，催化TTAGGG重復序列加到染色體末端。在大多數永生性細胞株和腫瘤細胞株中也可見端粒酶活性的表達。端粒酶反應超越了細胞的增殖限制，這可能是惡性腫瘤發生的一個先決條件。

傳統的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎測定端粒酶活性。由于需要大量的樣品材料，且檢驗靈敏度受局限, 這一方法已被端粒重復擴增法(omeric Repeat Amplification Protocol, TRAP)所取代。

標準的TRAP測定是通過pcr擴增端粒酶反應的產物，使用放射性標記，經凝膠電泳后，通過放射自顯影顯示結果。

這里介紹使用非放射性標記的檢測端粒酶的新方法：活性光密度酶聯免疫測定法。這種方法具有如下特點：

安全，無需使用放射性同位素

一步反應，使用即用的混合物使端粒酶介導的引物延伸和PCR擴增可在一個試管中進行。

應用廣泛，擴增后可適用于不同分析法。

靈敏，與放射性同位素TRAP測定相當。

可靠，準確、重復性好。

快速，6-8小時得到結果。

現介紹如下：

1.原理：

本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基礎上的，它將端粒酶介導的衍生產物進行PCR擴增, 并與后序的ELISA法結合在一起。 本法可分如下幾步：

(1)延伸/擴增：

*步：端粒酶將端粒重復序列(TTAGGG)加到帶有生物素標記的P1-TA引物的3’末端。

第二步：利用引物P1-TS和T2通過PCR擴增這些延伸出的產物，產生出的PCR產物帶有特異的端粒酶-6-核苷酸的延伸產物。

(2)ELISA測定：

PCR產物變性后與Dig標記的端粒特異的重復檢測探針雜交。終產物可經生物素標記的探針固定到親和素包被的微量滴定板上。固定的PCR產物可用與過氧化物酶交聯的抗復合物(anti-Dig-POD)檢出。zui后，經過分解底物TMB形成一種有色的反應物，再用酶標儀進行檢測。

2.應用：

本法可用于從培養細胞和其他生物樣品的抽提物進行端粒酶活性的高敏感性檢測。

3. 檢測步驟：

3.1 樣品制備：

3.1.1 細胞提取物的制備：

—按標準方法采集并進行細胞記數(trygan染色，使用血細胞計數器。)

—每個反應取2*105細胞移入一個新的試管。

—2-8℃下以3000g離心10分鐘形成細胞團。

—小心移去上清液，將細胞在PBS中重懸并重復離心步驟。

—小心移去上清液，細胞小團可放在-80℃下儲存。

—若準備細胞提取物，將細胞小團在200ul裂解試劑中重懸，冰上預冷并提吸至少3次，冰中孵育30分鐘。如果將冷凍細胞團用于提取，加入裂解液前在冰上融化細胞團。

—2-8℃，16000g離心裂解物20分鐘。

—小心移去上清液并移入新的離心管中。保證將細胞殘渣帶入，我們推薦僅抽吸175ul細胞提取物。

—繼續進行TRAP反應。

—如不立即進行TRAP反應，將小份細胞抽提物在液氮中休克性冷凍，將提取物儲存在-80℃。

3.1.2 組織中提取物的制備：

—測定端粒酶活性的組織標本準備，需要小心的采樣并保存臨床材料，因為腫瘤細胞的污染可產生正常組織中的假陽性信號，而由于不恰當的保存也可在腫瘤樣本中產生陰性信號。如不是立即用于端粒酶PCR ELISA組織樣本應以小片在液氮中休克性冷凍，并保存在-80℃。

—冰上孵育30分鐘。

—2-8℃，16000g離心細胞裂解液20分鐘。可用冷凍臺式離心機及離心管。

—小心將上清液移入新的離心管中，確保無組織殘片被帶入，我們建議僅抽提175ul組織提取物，以標準方法測定蛋白濃度，在液氮中休克性冷凍小份組織提取物，將提取物存放在-80℃。

3.2 端粒酶重復序列擴增步驟(TRAP反應)。

—對于每一待例檢測樣本，先將25ul反應復合物加入適合PCR擴增的管中，加入1-3ul細胞提取物(相當于1*103-3*103細胞或1-50ug總蛋白)。并加入無菌水至總體積50ul，所有吸取步驟在冰上進行。

—將離心管置于PCR儀中，照下列步驟進行引物延伸/擴增反應。

3.3 雜交及ELISA反應流程：

—每個樣品取20ul變性試劑加入適宜的離心管中，若有大量樣本，建議使用無核酸酶包被的微孔板MTP。

—加入5ul擴增產物，15-25℃孵育10分鐘。

—每個離心管內加入225ul雜交緩沖液，用振蕩器*混勻。

(如需要，雜交混合物量可以用于二次檢測擴增產物。)

—取出100ul混合物加入試劑盒中已包被的微孔板的每個孔中，并用蓋子蓋住小孔以防蒸發。

—將MTP微孔板置于37℃，300rpm的振蕩器中孵育2小時。

—棄去全部雜交液，以清洗緩沖液洗三次，每孔250ul每次至少30秒，小心棄去沖洗液。

—每孔加入100ul抗-DIG-POD工作液，用蓋子蓋上MTP，15-25℃(18-22℃)置于300rpm的搖床上孵育30分鐘。

—*棄去溶液，以每孔250ul清洗緩沖液沖洗5次，每次至少30秒，小心棄去沖洗緩沖液。

—每孔加入100ulTMB底物溶液預熱至室溫，蓋上蓋子，在300rmp的搖床上孵育10-20分鐘。

——不要移去反應底物，每孔加入100ul終止試劑以終止反應。

注意：加入終止液后等已反應的POD底物的顏色從藍轉黃，這是取得zui高敏感度所必要的。

——使用ELISA酶標儀，測定加入終止液后30分鐘內標本450nm吸收值(參照波長為690nm)。

4.結果分析：

吸光值為A450nm，參照空白對照讀數(A690nm)。

4.1 陰性對照：

將細胞提取物與無DNA酶的RNA酶預孵育，降解端粒酶內源性RNA作為檢測端粒酶的陰性對照，另一種方法為熱處理以取得陰性對照。用RNA酶處理標本，陰性對照zui大的吸收值為0.2450nm-690nm，如果數值較高，整個實驗包括TRAP反應需重新進行。

4.2 陽性對照：

陽性對照的吸收值在底物反應20分鐘后檢測，應高于1.5(A450nm-A690nm)，相當于使用1*103細胞進行檢測。如果數值較低，整個實驗包括TRAP反應需重新進行。

4.3 樣本：

將樣本的吸收值減去陰性對照的值。如果吸收值的差異(ΔA)高于0.2(A450nm-A690nm)可認為端粒酶陽性。

5. 常見問題分析及解決方案

1 陽性對照信號過低或無

1) 所用熱循環儀的型號不適合所設的熱循環程序，選擇適宜的循環條件。

2) 引物延長、擴增所用的水含有核酸酶。必須使用無核酸酶的重蒸水(DEPC或Velcorin處理)來制備試劑。

3) 試劑受核酸酶污染。另換陽性對照細胞提取物及樣本重復全部檢測。仔細檢查是否污染了DNA酶及RNA酶。

4) 孵育步驟未在300rmp振蕩器下進行。選用合適的振蕩器。

5) 抗DIG-POD工作液失效，必須使用新準備的抗DIG-POD工作液，檢查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并準備新鮮的工作液。

2 陰性對照信號過高

1) 陰性對照、裂解試劑、或反應混合物被端粒酶陽性細胞提取物污染，以RNA酶處理或65℃熱處理10分鐘是陰性對照失活。重復包括擴增在內的整個實驗。

2) 陰性對照、裂解試劑、反應復合物、或其它試劑可能被以前實驗的擴增產物所污染。

3) 在檢測步驟中，沖洗不充分，增加沖洗步驟。

4) 與TMB底物溶液的孵育過長，加入TMB底物溶液20分鐘內停止底物反應。

本文介紹的方法可應用于端粒酶活性的高敏感性檢測實驗中。是結合了聚合酶鏈式反應和ELISA兩種實驗技能的端粒活性檢測方法，整個過程應注意在低溫條件下進行，另外，實驗中需要用到的試劑、管子、槍頭等應洗滌干凈，避免PCR殘余污染。

1994年，Kim發明的TRAP由于具有靈敏度高等優點曾被廣泛應用于端粒酶的活性檢測中，不過安全性不夠，現在的端粒酶活性檢測實驗都在其基礎上進行了改良，更顯和人性化。以下是具體的實驗方法：

端粒是真核生物染色體末端的特異DNA-蛋白結構，端粒DNA是一系列重復的富含G的DNA序列，這一序列在生物進化中有高度的保守性(人重復序列為TTAGGG)。已確認端粒在保護基因組DNA不被降解、防止染色體有害的結合(如染色體末端融合、重排、染色體移位和染色體缺失)中起重要作用。

由于dna聚合酶不能復制線性DNA的zui末端，多數正常體細胞的端粒末端每經一個復制循環就進行性縮短。這一現象在體內和體外都得到證實，并且可能與真核生物的正常體細胞有限的繁殖能力有關。

這一活性可能在與細胞衰老有關的情況中起作用。與體細胞相對照，生殖細胞是永生性的，它需要為將來器官形成保存全部的遺傳信息。因此它必須對抗端粒縮短。這一工作通過在基因組染色體的末端添加新的端粒重復序列而完成。

端粒酶是一種核糖核蛋白，它們用自身的RNA成份的互補序列作模板，催化TTAGGG重復序列加到染色體末端。在大多數永生性細胞株和腫瘤細胞株中也可見端粒酶活性的表達。端粒酶反應超越了細胞的增殖限制，這可能是惡性腫瘤發生的一個先決條件。

傳統的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎測定端粒酶活性。由于需要大量的樣品材料，且檢驗靈敏度受局限, 這一方法已被端粒重復擴增法(omeric Repeat Amplification Protocol, TRAP)所取代。

標準的TRAP測定是通過pcr擴增端粒酶反應的產物，使用放射性標記，經凝膠電泳后，通過放射自顯影顯示結果。

這里介紹使用非放射性標記的檢測端粒酶的新方法：活性光密度酶聯免疫測定法。這種方法具有如下特點：

安全，無需使用放射性同位素

一步反應，使用即用的混合物使端粒酶介導的引物延伸和PCR擴增可在一個試管中進行。

應用廣泛，擴增后可適用于不同分析法。

靈敏，與放射性同位素TRAP測定相當。

可靠，準確、重復性好。

快速，6-8小時得到結果。

現介紹如下：

1.原理：

本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基礎上的，它將端粒酶介導的衍生產物進行PCR擴增, 并與后序的ELISA法結合在一起。 本法可分如下幾步：

(1)延伸/擴增：

*步：端粒酶將端粒重復序列(TTAGGG)加到帶有生物素標記的P1-TA引物的3’末端。

第二步：利用引物P1-TS和T2通過PCR擴增這些延伸出的產物，產生出的PCR產物帶有特異的端粒酶-6-核苷酸的延伸產物。

(2)ELISA測定：

PCR產物變性后與Dig標記的端粒特異的重復檢測探針雜交。終產物可經生物素標記的探針固定到親和素包被的微量滴定板上。固定的PCR產物可用與過氧化物酶交聯的抗復合物(anti-Dig-POD)檢出。zui后，經過分解底物TMB形成一種有色的反應物，再用酶標儀進行檢測。

2.應用：

本法可用于從培養細胞和其他生物樣品的抽提物進行端粒酶活性的高敏感性檢測。

3. 檢測步驟：

3.1 樣品制備：

3.1.1 細胞提取物的制備：

—按標準方法采集并進行細胞記數(trygan染色，使用血細胞計數器。)

—每個反應取2*105細胞移入一個新的試管。

—2-8℃下以3000g離心10分鐘形成細胞團。

—小心移去上清液，將細胞在PBS中重懸并重復離心步驟。

—小心移去上清液，細胞小團可放在-80℃下儲存。

—若準備細胞提取物，將細胞小團在200ul裂解試劑中重懸，冰上預冷并提吸至少3次，冰中孵育30分鐘。如果將冷凍細胞團用于提取，加入裂解液前在冰上融化細胞團。

—2-8℃，16000g離心裂解物20分鐘。

—小心移去上清液并移入新的離心管中。保證將細胞殘渣帶入，我們推薦僅抽吸175ul細胞提取物。

—繼續進行TRAP反應。

—如不立即進行TRAP反應，將小份細胞抽提物在液氮中休克性冷凍，將提取物儲存在-80℃。

3.1.2 組織中提取物的制備：

—測定端粒酶活性的組織標本準備，需要小心的采樣并保存臨床材料，因為腫瘤細胞的污染可產生正常組織中的假陽性信號，而由于不恰當的保存也可在腫瘤樣本中產生陰性信號。如不是立即用于端粒酶PCR ELISA組織樣本應以小片在液氮中休克性冷凍，并保存在-80℃。

—冰上孵育30分鐘。

—2-8℃，16000g離心細胞裂解液20分鐘。可用冷凍臺式離心機及離心管。

—小心將上清液移入新的離心管中，確保無組織殘片被帶入，我們建議僅抽提175ul組織提取物，以標準方法測定蛋白濃度，在液氮中休克性冷凍小份組織提取物，將提取物存放在-80℃。

3.2 端粒酶重復序列擴增步驟(TRAP反應)。

—對于每一待例檢測樣本，先將25ul反應復合物加入適合PCR擴增的管中，加入1-3ul細胞提取物(相當于1*103-3*103細胞或1-50ug總蛋白)。并加入無菌水至總體積50ul，所有吸取步驟在冰上進行。

—將離心管置于PCR儀中，照下列步驟進行引物延伸/擴增反應。

3.3 雜交及ELISA反應流程：

—每個樣品取20ul變性試劑加入適宜的離心管中，若有大量樣本，建議使用無核酸酶包被的微孔板MTP。

—加入5ul擴增產物，15-25℃孵育10分鐘。

—每個離心管內加入225ul雜交緩沖液，用振蕩器*混勻。

(如需要，雜交混合物量可以用于二次檢測擴增產物。)

—取出100ul混合物加入試劑盒中已包被的微孔板的每個孔中，并用蓋子蓋住小孔以防蒸發。

—將MTP微孔板置于37℃，300rpm的振蕩器中孵育2小時。

—棄去全部雜交液，以清洗緩沖液洗三次，每孔250ul每次至少30秒，小心棄去沖洗液。

—每孔加入100ul抗-DIG-POD工作液，用蓋子蓋上MTP，15-25℃(18-22℃)置于300rpm的搖床上孵育30分鐘。

—*棄去溶液，以每孔250ul清洗緩沖液沖洗5次，每次至少30秒，小心棄去沖洗緩沖液。

—每孔加入100ulTMB底物溶液預熱至室溫，蓋上蓋子，在300rmp的搖床上孵育10-20分鐘。

——不要移去反應底物，每孔加入100ul終止試劑以終止反應。

注意：加入終止液后等已反應的POD底物的顏色從藍轉黃，這是取得zui高敏感度所必要的。

——使用ELISA酶標儀，測定加入終止液后30分鐘內標本450nm吸收值(參照波長為690nm)。

4.結果分析：

吸光值為A450nm，參照空白對照讀數(A690nm)。

4.1 陰性對照：

將細胞提取物與無DNA酶的RNA酶預孵育，降解端粒酶內源性RNA作為檢測端粒酶的陰性對照，另一種方法為熱處理以取得陰性對照。用RNA酶處理標本，陰性對照zui大的吸收值為0.2450nm-690nm，如果數值較高，整個實驗包括TRAP反應需重新進行。

4.2 陽性對照：

陽性對照的吸收值在底物反應20分鐘后檢測，應高于1.5(A450nm-A690nm)，相當于使用1*103細胞進行檢測。如果數值較低，整個實驗包括TRAP反應需重新進行。

4.3 樣本：

將樣本的吸收值減去陰性對照的值。如果吸收值的差異(ΔA)高于0.2(A450nm-A690nm)可認為端粒酶陽性。

5. 常見問題分析及解決方案

1 陽性對照信號過低或無

1) 所用熱循環儀的型號不適合所設的熱循環程序，選擇適宜的循環條件。

2) 引物延長、擴增所用的水含有核酸酶。必須使用無核酸酶的重蒸水(DEPC或Velcorin處理)來制備試劑。

3) 試劑受核酸酶污染。另換陽性對照細胞提取物及樣本重復全部檢測。仔細檢查是否污染了DNA酶及RNA酶。

4) 孵育步驟未在300rmp振蕩器下進行。選用合適的振蕩器。

5) 抗DIG-POD工作液失效，必須使用新準備的抗DIG-POD工作液，檢查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并準備新鮮的工作液。

2 陰性對照信號過高

1) 陰性對照、裂解試劑、或反應混合物被端粒酶陽性細胞提取物污染，以RNA酶處理或65℃熱處理10分鐘是陰性對照失活。重復包括擴增在內的整個實驗。

2) 陰性對照、裂解試劑、反應復合物、或其它試劑可能被以前實驗的擴增產物所污染。

3) 在檢測步驟中，沖洗不充分，增加沖洗步驟。

4) 與TMB底物溶液的孵育過長，加入TMB底物溶液20分鐘內停止底物反應。

本文介紹的方法可應用于端粒酶活性的高敏感性檢測實驗中。是結合了聚合酶鏈式反應和ELISA兩種實驗技能的端粒活性檢測方法，整個過程應注意在低溫條件下進行，另外，實驗中需要用到的試劑、管子、槍頭等應洗滌干凈，避免PCR殘余污染。