一:電泳(Electrophoresis):帶電粒子在直流電場中向著所帶電性相反的電極移動的現象。
電泳分析技術:利用電泳現象進行物質分離的技術。
二:影響電泳的因素:
1. 帶電粒子的帶電狀態(電量和電性)。
2. 帶電粒子的分子量大小和分子形狀。
3. 電場強度。
4. 緩沖液的PH 值,組成成分及離子強度。
5. 支持介質的吸附和電滲作用。
三:蛋白質電泳的機理
1. 蛋白質是兩性電解質:
當 PH=PI 時,所帶凈電荷為零;當 PH>PI 時,所帶凈電荷為負;當 PH距離PI 越遠時,所帶電量越多。
2. 不同蛋白質等電點不同,在同一緩沖液中所帶電性及電量不同,電泳時遷移的方向和速率不同。
3. 不同蛋白質分子量大小和分子形狀不同,故遷移率不同。
四:實驗:血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳
(一) 原理:
1. 人血清蛋白質的分類,等電點,分子量及遷移率:
電泳技術及其應用
2. 在PH8.6 的緩沖液中均帶負電,泳向正極。
3. 染色漂洗后,可見5 條帶(定性)。
4.洗脫比色后可定量(今天不做)。
(二) 器材和試劑:
1. 電泳儀 2. 電泳槽 3. 載波片,點樣器,鑷子
4. 染缸 5. 醋纖膜 6. 巴比妥緩沖液
7. 氨基黑染液 8. 漂洗液
(三) 操作:
1. 準備:
1) 將緩沖液倒于電泳槽中(每池約500ml)。
2) 將醋纖膜浸泡在緩沖液中20min。
3) 每人取一張醋纖膜(用鑷子夾?。脼V紙吸干水分,找到粗糙面,在距一端2cm 處劃點樣線,用鉛筆或圓珠筆寫上學號。
2. 加樣:用加樣器加樣;取樣要適量、均勻(點樣器下端均勻沾有一層血清即可);點樣于劃線處,點樣
時用力要均勻,只能點一次。
3. 上橋:粗糙面向下,點樣端位于負極。紗布搭橋。
4. 平衡:蓋上蓋子,靜置5min。
5. 電泳:120V,電泳45min(電泳使不得用手觸摸電泳槽內任何物品,以防觸電)。
6. 染色和漂洗:染色5min;初漂、次漂各2min:用鑷
子夾拄醋纖膜輕輕搖動,或輕輕晃動染缸。
7. 定量:剪下各條帶,洗脫,比色。(不做)
(四) 結果:參見原理。
(五) 臨床意義:
1. 白蛋白降低:
1) 合成能力不足:肝功能下降。
2) 合成原料不足:饑餓,腹瀉,腫瘤晚期。
3) 去路增加:腎病綜合癥,嚴重燒傷,大出血等。
4) 消耗過多:糖尿病,甲亢等
2. 球蛋白增加:感染,多發性骨髓瘤,自身免疫性疾病等。
3. 球蛋白降低:皮質功能亢進,免疫缺陷病。
4. 肝病時:A ,α2-G ,β- G ,α1- G , γ- G A/G下降甚至倒置。
5. 腎病時:
1) 早期:選擇性蛋白尿:分子量較小的蛋白質丟失,含量下降。如白蛋白。
2) 后期:非選擇性蛋白尿:除分子量較小的蛋白質丟失,含量下降外,分子量較大的蛋白質(如γ- 球蛋白)也丟失,含量也下降。
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