SD大鼠

硼酸硼砂緩沖液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’

眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

一、實(shí)驗步驟

1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的 D-Hanks’平衡鹽液中。

2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm³ 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min，中間搖晃一次。

3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。

4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2～3 次。

5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。

6. 過濾后的細(xì)胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細(xì)胞懸液。

7. 細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×10⁵/cm²  種入6 孔板內(nèi)，放入CO₂ 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1×10^-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。

1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進(jìn)行改動：如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進(jìn)行消化，有人還直接進(jìn)行吹打，都可行。

2. 上面雖然時大鼠皮層神經(jīng)元，但是同樣適用于小鼠，但是應(yīng)該選擇孕13 d 左右的小鼠。

3. 神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞，因此在接種時細(xì)胞的密度一定要夠。

4. 在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經(jīng)細(xì)胞的影響 是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養(yǎng)中還是用同 一來源(廠家)的玻片。

5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基，那么就方便了(不用加 AraC):

(1)把細(xì)胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 半量換液。

(2)把細(xì)胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種。

(3)可以用新生1 d 內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。