Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒

產品簡介：

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發育、組織修復、內環境的穩定等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。

用標記了FITC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜與細胞核結合呈現紅色。將AnnexinⅤ與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+ /PI+ ）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+ /PI-）。

產品組成：

使用方法：

1.       離心收集懸浮細胞，微量離心機轉速2000RPM，離心時間5min，棄培養基。

2.     用冷PBS洗滌細胞兩次。

3.     用400ul 1X Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1 X 10⁶ cells/ml。

4.     在細胞懸浮液中加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。

5.     加入10ul PI后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。

6.     在1小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

流式細胞儀分析：

經處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。激發波長為488nm。

按照常規的流式凋亡檢測的操作即可。 Annexin V-FITC的綠色熒光通過FL1通道檢測；PI紅色熒光通過FL2或FL3通道檢測，建議使用FL3。

可以參考下面的流式設置：

使用流式細胞儀正確分析Annexin V-FITC/PI雙染的細胞前要求儀器的熒光補償來去除兩種染料激發光之間的疊加。因為熒光補償設置與PMT的電壓直接相關，所以不同儀器之間的補償不同。建議在實驗開始階段分析經Annexin V、PI分別單染的細胞來調整熒光補償去除光譜重疊。根據未處理細胞空白對照和經Annexin V、PI分別細胞染色后的單染對照的分析設定十字門的位置。

1.      上樣未經染色的細胞，在線性FS-SS點圖上顯示細胞并設門圈出目標細胞群體。

2.      建立LogFL1-LogFL2（用FL3）雙參數點圖并分析以上光散射圖中設門的細胞；保證>98%的細胞處于在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中心區域。

3.      檢測annexin V-FITC單染的細胞并檢查FL1-FL2（或FL3）散點圖，保證在左上和右上象限內沒有顆粒。如果有顆粒出現在上端象限則說明有熒光滲漏；此時FL1的熒光被FL2 （或FL3）PMT檢測到了。為了糾正這種現象，增加FL1漏到FL2（或FL3）熒光的補償%（這可能在1-5%之間）。如果這個調節沒有有效地去除FL2的陽性信號，此時要降低FL2（或FL3） PMT的電壓。

4.      檢測PI單染的細胞并檢查FL1-FL2（或FL3）散點圖，保證在右上和右下象限內沒有顆粒。如果有顆粒出現在右側象限則說明有熒光滲漏；此時PI的熒光被FL1 PMT檢測到了。為了糾正這種現象，增加FL2（或FL3）漏到FL1熒光的補償%（這可能在15-25%之間）。如果這個調節沒有有效地去除FL1的陽性信號，此時要降低FL1 PMT的電壓。

     注：如果在以上調節補償過程中更改了PMT的電壓，建議重復3、4步驟，確保不引起過度熒光補償。過度補償可以從陽性細胞十分貼近從標這一現象觀察出來。一個恰當的補償應該是單陽性細胞熒光強度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細胞的熒光強度一致。

5.     設定十字門的位置，FL1和FL2（或FL3）的劃定方法如下：

5.1 設定FL1標尺位置: 處于左下象限內的大群細胞是Annexin V染色陰性的細胞（一般這些細胞會在FL1軸方向上升至2個對數坐標值）。將垂直的FL1標尺設定在緊靠Annexin V陰性群體右側0.1-0.2Log單位的地方。

5.2 設定FL2 （或FL3）標尺位置: 可以通過一定數據的雙陽性細胞來區分PI+和PI-的細胞群體。在此條件下可能會識別出兩群細胞，一是位于散點圖的右下方（ANN+/PI-）還有就是右上方（ANN+/PI+）。水平線可以置于這兩群細胞的中間。如果在分析的細胞群體中沒有PI+細胞，區分PI+細胞是參照雙陰性細胞群體，將水平線設在雙陰性細胞以上0.1-0.3 Log單位的地方。

注：在陰性群體門以外的細胞可被識為Annexin V或Annexin V和PI陽性的細胞。

熒光顯微鏡觀察：

1.     滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

注：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。

2.     在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

儲存條件：

2-8℃保存。

有效期：

一年。

注意事項：

1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質，在操作時請注意避光。

4.成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上PS的密度、發生凋亡時PS翻轉的比例、誘導細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導凋亡的時間等，把這些影響因素進行優化對實驗成功與否至關重要。

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