1. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內切片( 也可- 80℃保存),厚度為 5~6μm。
2. 載玻片可不打底,裱片后,立即用電吹風吹干。
3. 如不馬上染色,可密封后- 20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘。
5. PBS 洗 2 次,每次 5 分鐘,( 必要時應用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)
6. 3% H2O2滅活內源性過氧化物酶,20 分鐘,避光;
7. 用 PBS 洗 2 次,每次 5 分鐘;
8. 正常血清封閉:從染片缸中取出切片,擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 (保持組織呈濕潤狀態,)滴加正常山羊或兔血清 (與第二抗 體 同源動物血清)處理,37℃,15 分鐘。
附:正常血清配制 ( 或按試劑盒規定的濃度配制):按 1:20比例,用 PBS 配制,每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計算。
9.滴加*抗體:用濾紙吸去血清,不洗,直接滴加*抗體,37℃ 2 小時(也可置于 4℃冰箱過整夜) 。
10.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
11.滴加生物素化的二抗,37℃,40 分鐘。
12.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
13.滴加三抗 (SAB 復合物) ,37℃,40 分鐘。
14.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
15.DAB 顯色,鏡下觀察,適時終止(自來水沖終止) 。
附:DAB 的配制① 儲備液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待*溶解后分裝成 1ml,100μl,50μl ,20μl 等,-20℃,凍存。② 工作液:DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
16.自來水(細水)充分沖洗。
17.蘇木素復染,室溫,30 秒,自來水沖洗。
18.自來水沖洗返藍,15 分鐘。
19.梯度酒精脫水:80%,2 分鐘 95%,2 分鐘 100%,2 次,5 分鐘。
20.二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分鐘
21.封片:加拿大樹膠(或中性樹膠)封片。
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