利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。在提取過程中,染色體會發生機械斷裂,產生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。
實驗方法
- 氯化銫法
- CTAB法
實驗方法原理 | 加入一定量的異丙醇或乙醇,基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中, 可用玻棒將其取出,而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達到提取的目的。 |
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實驗材料 | 植物組織 |
試劑、試劑盒 | 抽提緩沖液 十二烷基肌氨酸鈉 TE 異丙醇 溴化乙錠 氯化銫 |
儀器、耗材 | 離心機 |
實驗步驟 | 1. 收取10~50 g 新鮮的植物組織。 2. 植物組織用冷的無菌水洗滌、吸干,放人液氮中凍結,用研缽和研杵研成細粉。 3. 將凍結的細粉放入250 ml 的離心瓶中,立即加入抽提緩沖液約每克植物5~10 ml,輕輕攪拌混勻。 4. 加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達1%,于溫育1~2 h。 5. 用JA-14轉子4℃,5 500 g 離心10min 保留上清,必要時重復此歩驟以除去殘渣。 6. 加人0.6體積異丙醇,混合,如果看不見沉淀,于-20℃放置30 min,用JA-14轉子4℃,7 500 g 離心15 min,棄上清。 7. 沉淀用9 ml TE緩沖液重懸,加入9.7 g 固體氯化銫,混勻,冰上放置30 min,用JA-14轉子,7 500 g 離心10 min,保留上清。 8. 加入0.5 ml 10 mg/ml 的溴化乙錠,冰上放置30 min,4℃ 7500 g 離心10min. 9. 將上清轉入兩個5 ml 的快封超離心管中,并封口。 10. 用VTi80轉子20℃ 525 000 g 離心4 h,或20℃,300 000 g 離心,用15號針頭和注射器收集帶。 11. 用氯化艷飽和的異丙醇重復抽提DNA以除去溴化乙錠。 12. 加入2體積水和6體積100%乙醇,混勻,-20℃放置1 h,用JA-20或JA-21轉子4℃,7500 g 離心10 min。 13. 沉淀用TE緩沖液重懸,加入1/10體積的3 mol/l 乙酸鈉和2體積的100%乙酵重懸,重復離心。 14. 沉淀晾干后用TE緩沖液重懸 |
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