簡(jiǎn)述成人胰腺消化、胰島分離方法:
尸體胰腺原位灌洗后置UW液中,4℃保存運(yùn)輸。到實(shí)驗(yàn)室后在4℃ Euro-Collins液中清除非胰組織,從胰管內(nèi)插入穿刺針,絲線縫扎后用注射器灌注Liberase酶溶液(1.5 mg/ml)。胰腺充分膨脹后將胰腺切片,置消化罐中并放入數(shù)顆玻璃珠,加500 μm 孔徑的不銹鋼絲網(wǎng),旋緊罐蓋。開啟蠕動(dòng)泵將剩余的Liberase酶溶液泵入罐內(nèi),控制罐內(nèi)溫度37℃,手動(dòng)振搖消化罐循環(huán)消化,于10分鐘后開始取樣鏡檢,待大部分胰島分離后用冷的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液降溫稀釋終止消化。收集消化物用10% FBS 1640離心洗滌,將消化物混懸于150 ml UW液中,4℃冰浴30分鐘。
加載1.100 Ficoll到COBE 2991細(xì)胞掏洗機(jī),從COBE排除空氣,啟動(dòng)COBE 旋轉(zhuǎn)2,400 rpm,分別加1.100和1.077的Ficoll到梯度形成儀,將混合形成的連續(xù)梯度液泵入COBE,再泵入含組織UW液,zui后泵入Hanks液,讓COBE 在2,400 rpm轉(zhuǎn)5分鐘后分管收集純化后的組織,鏡檢各管,將含有胰島的各管組織合并,用10% FBS 1640離心洗滌兩次,取樣做胰島鑒定和計(jì)數(shù)。
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