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干擾素的實(shí)驗(yàn)步驟及其注意事項(xiàng)

來(lái)源:上海滬鼎生物科技有限公司   2013年03月27日 15:37  

干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑,并不直接殺傷或抑制病毒,而主要是通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白,從而抑制乙肝病毒的復(fù)制;同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力,從而起到免疫調(diào)節(jié)作用,并增強(qiáng)抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白),是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們?cè)谕N細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng),以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。

實(shí)驗(yàn)步驟
 

 

 

1. 制備誘生劑:采用NDVF系弱毒株,以雞胚尿囊液形式保存于-20℃,

其血凝滴度穩(wěn)定在1:640~1:1 280之間。大量繁殖時(shí),用0.5%水解乳蛋白稀釋100~1 000倍,接種于9日齡雞胚尿囊腔,置37℃培養(yǎng)72h后,收獲尿囊液,效價(jià)測(cè)定應(yīng)大于1:640,無(wú)菌檢查應(yīng)合格。

2. 制備誘生細(xì)胞:無(wú)菌采取人外周血(多用人臍帶血,或血庫(kù)貯藏血),置于含肝素的無(wú)菌瓶?jī)?nèi),于4℃保存不超過(guò)24h,誘生細(xì)胞(白細(xì)胞)不單獨(dú)提取,以全血代替。

3. 制備粗制干擾素:

1) 加誘生劑,按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液,其血凝滴度不低于1:640);

2) 加溫吸附,將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h,每隔15min晃動(dòng)一次,使NDVF吸附于白細(xì)胞上。然后以1000r/min離心20min,棄上清,留沉淀物;

3) 加營(yíng)養(yǎng)液孵育誘生,按抗凝全血的1~2倍量加Eagle營(yíng)養(yǎng)液于上述沉淀物中,混勻,置35~36℃溫箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18~20h;

4) 離心及酸處理,將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min,取上清,以6mol/L鹽酸將其pH值調(diào)至2.0,置4℃冰箱5天滅活NDV;

5) 中性化,經(jīng)5天酸化后,再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.2~7.4,即為粗制干擾素。

4. 制備精品干擾素:

1) KCNS沉淀,取上述粗制干擾素,加KCNS并用2mol/L HCl調(diào)pH值為3.5,然后以2 000r/min離心30min取沉淀;

2) 酒精提取,將沉淀溶于95%酒精(預(yù)冷至-20℃),用2mol/L NaOH調(diào)pH值為4.2,以2 000r/min離心30min取上清;用2mol/L HCl調(diào)pH值至3.5,離心后取上清,再將pH值調(diào)至5.6,離心后取上清,zui后將pH值調(diào)至7.1,離心后取沉淀;

3) 過(guò)碘酸鈉沉淀,將沉淀溶于PBS中,加過(guò)碘酸鈉,并調(diào)pH值為4.5,用50%乙醇10倍稀釋,離心后取上清,將上清液對(duì)0.3mol/L (NH4 )2 CO3 (pH值7.6)在4℃下透析過(guò)夜。

4) sephacryl S200柱層析:將sephacryl S200按要求處理后裝柱(4~5×100cm柱),用PBS平衡后,加樣(即上述上清液),用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測(cè),收集相應(yīng)峰即為精制干擾素。取樣進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,按結(jié)果進(jìn)行稀釋,分裝并凍干。

5. 檢定

1) 效價(jià)測(cè)定

a. 制備攻擊病毒:將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細(xì)胞上傳代后,

再在豬細(xì)胞(IBRS)上傳3~5代,使其對(duì)IBRS有良好致病效應(yīng),其TCID50應(yīng)穩(wěn)定(一般在10-6 ~10-7 之間)。

b. 準(zhǔn)備測(cè)定細(xì)胞:生長(zhǎng)良好的幼齡IBRS單層細(xì)胞。

c. 測(cè)定:取上述單層細(xì)胞分為若干組,每組加不同稀釋度的干擾素,置37℃孵育20~24h,然后每管均用100個(gè)TCID50的VSV攻擊,置37℃ 48~72h孵育后,觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。病毒對(duì)照組CPE>75%,正常細(xì)胞對(duì)照組CPE=0,即認(rèn)為該測(cè)定系統(tǒng)有效。干擾素判定標(biāo)準(zhǔn)是以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位。

2) 酸堿度測(cè)定

取本品10支,加水溶解,精密測(cè)量pH值應(yīng)為6.0~7.5。

3) 水分測(cè)定

按磺硫溶液法測(cè)定,不得超過(guò)3%。

4) 安全試驗(yàn)

取本品加水溶解,小鼠尾靜脈注射,48h內(nèi)不得有死亡。

5) 熱原檢查

取本品1支,加水溶解,依法檢查,應(yīng)符合規(guī)定。

6) 菌檢

取本品3支,無(wú)菌水溶解,分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)1周,應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

7) 超敏反應(yīng)

取健康豚鼠6只,每只腹腔注射本品適量,連續(xù)3次,于20天后再于耳靜泳注入本品適量,應(yīng)無(wú)過(guò)敏反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生。

注意事項(xiàng)

1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時(shí),種毒應(yīng)無(wú)菌檢查合格,且滴度在1:640以上。收毒時(shí),應(yīng)將污染的雞胚棄去。

2. 不必從血液中將白細(xì)胞提取出來(lái),因紅細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素有營(yíng)養(yǎng)作用。純化的白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素效價(jià)不一定高。

3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV,而在pH值20時(shí),干擾素是穩(wěn)定的。

4. 在常溫下干擾素半衰期很短。故各種操作要在低溫環(huán)境下進(jìn)行,動(dòng)作要迅速,純化所用試劑要作預(yù)冷處理。干擾素粗品及精品要及時(shí)置低溫下存放。效價(jià)測(cè)定時(shí),干擾素應(yīng)于臨用時(shí)現(xiàn)溶解。

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