透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜,而蛋白質大分子不能透過,可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
(1)將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內,液面稍留空隙,緊扎。
(2)浸入0.02mol/pH
7.1~7.4的PBS中(懸于大于標記物體積約50~100倍的PBS內),在4℃中透析,每日更換3~4次PBS,約5~7天,透析液中無熒即可(在熒光光源照射下)。
葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法,詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15~18ml(按床體積的5%~10%加樣),使其緩慢滲入柱內,待即將全部入柱時,加入PBS少許,關閉下口,停留30~40min ,使游離熒光充分進入細篩孔中,然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后,熒光抗體即向下移行,逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線,隨著大量洗脫液的不斷加入,二者分離距離越來越大,熒光抗體zui先流出,分前、中、后三部分收集,測F/P比值,合格者合并,濃縮,分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白(發(fā)生沉淀反應),繼續(xù)洗脫,游離熒光素則相繼被洗脫下來,至洗脫液中無蛋白和熒光素后,此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類,可先在過柱前透析一夜,否則,NH4+太濃,在蛋白未*洗脫時即出現NH4+,因而影響提純與回收蛋白,一般待洗脫液出現蛋白時,即進行收集,之后出現SO4++(用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀)。zui后是NH4+,(用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀),待洗脫液無SO4++及NH4+后可再用。
如僅用小量熒光抗體,可用1×20cm的柱層析柱,取2g Sephadex G-50裝柱,即可過濾2~3.5ml熒光抗體。
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