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一、體外蛋白表達試劑盒實驗前準備
試劑解凍與儲存
CFPE Master Mix：從-80℃取出后置于冰上緩慢解凍，避免反復凍融(解凍后3小時內完成實驗)。
陽性對照模板(T7P-GFP或LET)：儲存于-20℃以下，解凍后同樣需冰上操作。
關鍵提示：使用無核酸酶(Nuclease-Free)的耗材和試劑，防止DNA/RNA降解。
模板準備
質粒模板：需高純度(如PCR純化試劑盒處理)，洗脫液使用無核酸酶水，避免鹽離子干擾反應。
線性模板：通過無縫克隆技術制備后純化，濃度調整至10-100 ng/μL，確保蛋白質產量。
故障排查：若模板含核酸酶或抑制劑(如Cl?、SDS)，會導致表達失敗，需重新純化模板。
二、反應體系配置
反應體系設計
總反應體積：建議10 μL(可按比例放大)。
組分添加順序：
9 μL CFPE Master Mix(EC或ECL)；
1 μL陽性對照模板(或目標DNA模板，終濃度10 ng/μL)；
陰性對照：9 μL Master Mix + 1 μL無核酸酶水。
關鍵提示：DNA模板對濃度敏感，需充分混勻，避免移液誤差。
孵育條件優化
溫度：29℃(水浴鍋或培養箱預熱至目標溫度)。
時間：16小時(過夜孵育可提高產量)。
故障排查：若孵育后無表達，檢查溫度是否穩定(避免冷凝水進入反應管)。
三、蛋白表達與檢測
表達驗證
SDS-PAGE電泳：取1-2 μL反應液與5×Loading Buffer混合，95℃煮沸5分鐘，跑膠檢測目標蛋白條帶。
熒光檢測：若表達GFP等熒光蛋白，可直接用紫外燈觀察熒光信號。
故障排查：若無條帶，檢查模板是否正確、反應體系是否污染(如核酸酶殘留)。
包涵體處理
問題：原核表達中常見蛋白不正確折疊形成包涵體。
解決方案：
降低誘導溫度(如16℃)和誘導劑濃度(如0.1 mM IPTG)；
引入分子伴侶共表達；
包涵體純化后復性(常用尿素或鹽酸胍變性，再通過稀釋/透析復性)。
關鍵提示：復性需遵循“低溫、低濃度、小梯度”原則，可添加PEG8000或精氨酸提高成功率。
四、蛋白純化
粗分離與層析純化
細胞裂解：超聲破碎(功率30%，超聲3輪，每輪2次，冰上操作)或高壓勻漿。
離心過濾：12000 rpm離心30分鐘，獲取上清液。
親和層析：
His標簽蛋白：用Ni-NTA瓊脂糖珠或磁珠純化，洗滌緩沖液含20 mM咪唑，洗脫緩沖液含250 mM咪唑。
GST標簽蛋白：用GST瓊脂糖珠純化，洗滌緩沖液含0.1% Triton，洗脫緩沖液含10 mM還原型谷胱甘肽。
故障排查：若純化后雜蛋白多，可聯用離子交換層析(如陰/陽離子交換柱)或分子篩(凝膠過濾)。
濃縮與緩沖液置換
超濾濃縮：使用30K超濾管，4℃離心濃縮蛋白至目標體積。
脫鹽柱置換：將蛋白緩沖液置換為PBS或其他適宜緩沖液。
關鍵提示：超濾時避免蛋白沉淀(可添加甘油或DTT穩定蛋白)。
五、純度驗證與儲存
純度檢測
SDS-PAGE：考馬斯亮藍染色，目標蛋白純度應>90%。
Western Blot：用特異性抗體檢測目標蛋白，減少非特異性背景。
HPLC：高效液相色譜進一步驗證純度。
故障排查：若純度不足，檢查純化標簽是否暴露全(如His標簽被遮擋需優化表達條件)。
蛋白儲存
短期儲存：4℃保存(含50%甘油)，避免反復凍融。
長期儲存：-80℃分裝保存，添加蛋白酶抑制劑(如PMSF)防止降解。
關鍵提示：儲存前需測定蛋白濃度(如BCA法)，并記錄純度數據。
六、體外蛋白表達試劑盒常見問題與解決方案總結
| 問題 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 蛋白不表達 | 模板質量差、反應體系污染 | 重新純化模板，使用無核酸酶耗材，檢查陽性對照是否表達 |
| 包涵體形成 | 表達過快、缺少翻譯后修飾 | 降低誘導溫度/濃度，引入分子伴侶，包涵體復性 |
| 純化后雜蛋白多 | 純化方法單一、標簽暴露不足 | 聯用多種層析方法（如親和+離子交換），優化表達條件使標簽充分暴露 |
| 蛋白降解 | 細菌蛋白酶作用、序列不穩定 | 全程低溫操作，添加蛋白酶抑制劑，檢查蛋白序列N端原則，換用真核表達系統 |
| 儲存后蛋白活性下降 | 反復凍融、儲存條件不當 | 分裝保存，避免反復凍融，優化儲存緩沖液（如添加甘油、DTT） |
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