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A 液：主要成分是 BCA，還包含碳酸鈉、碳酸氫鈉、酒石酸鈉等緩沖物質(zhì)，以及氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 值，使溶液呈堿性環(huán)境，為雙縮脲反應(yīng)和 BCA 顯色反應(yīng)提供適宜條件 。其中，酒石酸鈉能夠穩(wěn)定 Cu2?，防止其在堿性條件下形成沉淀，保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。
B 液：為硫酸銅溶液，提供反應(yīng)所需的 Cu2? 。在使用時(shí)，需將 A 液和 B 液按照 50:1 的比例混合，配制成 BCA 工作液。混合后的工作液中，BCA 與 Cu2?形成 BCA - Cu2?復(fù)合物，該復(fù)合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)后生成紫色絡(luò)合物，用于后續(xù)的吸光度測(cè)定 。
蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：通常為已知濃度的牛血清白蛋白（BSA）溶液，作為定量的參照標(biāo)準(zhǔn)。不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，常見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度包括 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL 等，科研人員可根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行選擇和稀釋 。
稀釋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（如牛血清白蛋白）按照預(yù)設(shè)的濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)苽洳煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)品溶液。例如，取一定體積的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，用稀釋緩沖液（如 PBS）依次稀釋?zhuān)玫?0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL 等濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 。
加樣與反應(yīng)：在 96 孔板或比色皿中，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（一般每孔或每份 20 μL），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（加入等量的稀釋緩沖液替代樣本） 。隨后，向各孔或比色皿中加入 200 μL BCA 工作液，輕輕振蕩混勻，使溶液充分接觸 。將 96 孔板置于 37℃恒溫箱中孵育 30 分鐘，或在室溫下孵育 2 小時(shí)，使顯色反應(yīng)。
吸光度測(cè)定：使用分光光度計(jì)，在 562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品溶液和空白對(duì)照的吸光度值 。以標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常采用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程（y = ax + b，其中 y 為吸光度值，x 為蛋白質(zhì)濃度，a 為斜率，b 為截距） 。
樣本準(zhǔn)備：根據(jù)樣本類(lèi)型和蛋白質(zhì)濃度預(yù)估，對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。對(duì)于未知濃度的樣本，可先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適的稀釋倍數(shù)，確保樣本的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi) 。例如，對(duì)于細(xì)胞裂解液樣本，可先進(jìn)行 10 倍稀釋?zhuān)粑舛戎颠^(guò)高，再進(jìn)一步稀釋。
加樣與反應(yīng)：在 96 孔板或比色皿中加入 20 μL 稀釋后的樣本溶液，按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同的操作步驟，加入 200 μL BCA 工作液，振蕩混勻后進(jìn)行孵育，使樣本中的蛋白質(zhì)與 BCA 試劑充分反應(yīng)顯色 。
計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：測(cè)定樣本溶液在 562 nm 處的吸光度值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本的蛋白質(zhì)濃度 。若樣本進(jìn)行了稀釋?zhuān)璩艘韵鄳?yīng)的稀釋倍數(shù)，得到原始樣本的蛋白質(zhì)濃度 。
試劑儲(chǔ)存與使用規(guī)范：嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存 BCA 試劑，A 液和 B 液應(yīng)避光保存，防止 BCA 和 Cu2?發(fā)生氧化等反應(yīng)而失效 。使用前將試劑平衡至室溫，BCA 工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避免因放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致顯色性能下降 。在加樣過(guò)程中，使用移液器準(zhǔn)確吸取試劑和樣本，避免因加樣誤差影響定量結(jié)果。
樣本處理細(xì)節(jié)：確保樣本充分裂解或勻漿，使蛋白質(zhì)釋放到溶液中，避免因蛋白質(zhì)溶解導(dǎo)致定量結(jié)果偏低 。對(duì)于含有干擾物質(zhì)（如高濃度去污劑、還原劑）的樣本，需進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如透析、超濾等方法去除干擾物質(zhì)，或優(yōu)化反應(yīng)條件（如增加 BCA 工作液用量、延長(zhǎng)孵育時(shí)間） 。
實(shí)驗(yàn)條件控制：孵育溫度和時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)有顯著影響，需嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作 。在使用 96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，確保孔內(nèi)液體分布均勻，避免因邊緣效應(yīng)導(dǎo)致吸光度值偏差 。每次實(shí)驗(yàn)均需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以消除實(shí)驗(yàn)誤差，保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性 。
儀器校準(zhǔn)與維護(hù)：使用分光光度計(jì)前，需進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，確保波長(zhǎng)準(zhǔn)確性和吸光度測(cè)量精度 。定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)和清潔，避免因儀器故障或污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 。
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