為何穩轉細胞株成為生物制藥領域的“兵家必爭之地”？

穩轉細胞株被稱為“藥物研發的基石”，是單克隆抗體、雙抗、疫苗、ADC等生物制品規模化生產的核心環節，還是藥物生產成本、效率和質量的關鍵決定因素。一株高產穩定的細胞株有可能直接縮短藥物上市周期3-5年。穩定細胞株因其穩定性高，適用于各種研究應用，包括重組蛋白、抗體生產、結構生物學和功能性研究等。

那么，如何打造一株理想的穩轉細胞株呢？

義翹神州在重組表達方面不斷深耕，積累了大量穩定株開發的相關經驗，在提高穩定細胞株的生產能力、改善細胞狀態等方面有著豐富的經驗。義翹神州可提供從基因合成到穩定細胞株交付的一站式服務，為客戶的研究提供助力。

穩轉細胞株構建全流程：從載體設計到單克隆篩選

穩轉細胞株是指在細胞中持續穩定表達特定基因或者干擾特定基因表達的細胞株。與瞬時轉染相比，穩轉細胞株便于長期觀察基因對于細胞功能的影響及蛋白相互作用，尤其適合于體內實驗。穩轉細胞株將外源基因克隆至含有某種篩選標記的載體上，將載體轉染目的細胞并整合到染色體中，利用載體攜帶的篩選標記進行篩選，從而得到可穩定表達目的基因的細胞株。

穩轉細胞株的構建通常包含：載體構建、轉染、Pool篩選、克隆篩選、PCB建庫、MCB/WCB建庫、細胞株穩定性研究等內容。

生產用穩轉細胞株的構建首先從表達載體構建和細胞轉染開始。

首先，轉染過程是將表達目的蛋白的基因整合到載體中，再將該載體轉染至宿主細胞內。表達水平與基因拷貝數、基因整合位點的轉錄活性有關。常用的轉染方式有鈣轉、電轉、脂質體轉染、逆轉錄病毒轉染等。

常用的宿主細胞是CHO。CHO細胞種類多樣，包括CHO-K1、CHO-S、CH-DG44、CHOZN-GS、CHO-K1SV、CHO-K1SV GS-KO、CHO-K1 GS等。不同的CHO宿主細胞在細胞株構建中的表現各異。

接著，采用不同的篩選試劑獲得正確高效表達目的基因的細胞池（Pool）。

為了更高效地篩選出高表達水平的穩轉細胞株，表達載體上除了包含蛋白本身的基因以外，往往還含有各種篩選標記。篩選標記一般可以被分為兩大類：一類是以G418為代表的抗生素類篩選標記；另一類是以MTX為代表的細胞代謝篩選標記。

不同種類的篩選標記（源自文獻：DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720）

當目的基因被轉染到宿主細胞內，按照一定的細胞密度在合適的篩選壓力下進行傳代培養后便可獲得細胞池（Pool）。針對不同的宿主細胞可以采取不同的Pool篩選方式。例如：采用搖瓶進行大規模Pool篩選，或采用孔板進行迷你Pool篩選。Pool的表達量取決于轉染的方式、篩選壓力以及目的基因整合情況。

對于不同的目的蛋白分子，在Pool階段需要考察的標準不同。例如：對于常規新藥抗體，往往表達量為第-一評價標準；對于生物類似物，在Pool階段則需著重考察各項質量參數與原研藥的差異；對于雙特異性抗體，在此階段需開始考察正確裝配的比例，以期降低克隆篩選階段的風險。

細胞池Pool中的每個細胞特性各異，具有不同的基因整合位點、拷貝數、生長速率等，因此需將其中具有高產、穩定表達特性的細胞個體分離出來分別加以富集培養，獲得數百甚至上千的候選克隆供進一步篩選。

最后，單克隆篩選是關鍵操作步驟。

通常采用以下組合形式篩選單克隆，確保單個細胞形成單克隆：

義翹神州穩轉細胞株構建服務

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【參考文獻】

1.  Feng Li, et al. Cell culture processes for monoclonal antibody production. mAbs, 2010. DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720

2. Noh, et al. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep, 2018. doi.org/10.1038s41598-018-23720-9