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蛋白質印跡(Western Blot)保姆級教程 Part 2:解決WB的疑難雜癥
?背景有黑點，怎么辦？?詳情信息 1、封閉液未溶完-全-解決： A.確認BSA/牛奶有完-全溶解，建議增加溶解時間或溶解后取上清液使用。 B.利用0.45um濾紙過濾溶液，也可使用商品化試劑，如GTX30964（Trident Universal Protein Blocking Reagent，適用于WB、IHC、ICC/IF、ELISA）。 C.改變緩沖液，如換為BSA。 解決： 使用現配的溶液（Running/transfer/blocking/wash buffers）或商業化溶液減少因長菌長霉造成的黑點。 3、封閉液及抗體交互作用 解決：一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會與磷酸化抗體產生非特異性結合。因此，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液，同時洗脫溶液也用TBST，如此可降低黑點高背景的情況。 |
| ?過曝，怎么辦？?詳情信息 1、蛋白樣品過量 解決： 降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達量較高（如β-actin），此時可依蛋白表達量，進行微調。 解決： A.增加抗體稀釋倍數。 B.減少孵育時間，一般孵育時間為37℃，1小時。 C.于4℃過夜孵育，減少抗體非特異性結合。 解決： A.縮短曝光時間。 B.使用低靈敏的ECL。 |
| ?拖帶，怎么辦？?詳情信息 1、樣品不純，有雜質污染 解決： A.重新離心樣品，取上清液使用。 B.使用較純的試劑配制細胞裂解液或購買商業化產品。 C.使用Benzonase®核酸酶，Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度，減少核酸對跑膠的干擾。 D.全細胞或亞細胞萃取，使用商業化全細胞或亞細胞萃取試劑盒提取蛋白樣品，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。 解決： A.降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達量較高(如beta actin)，此時可依蛋白表達量，進行微調。 B.蛋白變性不完-全，也會使條帶成團拖曳；此時，可通過延長樣品加熱時間(一般約5分鐘)及調整SDS(一般是2 %)比例，使蛋白變性更完-全。 解決： A.縮短曝光時間。 B.使用低靈敏的ECL。 |
| ?條帶扭曲，怎么辦？?詳情信息 1、膠沒配好 解決： A.確保APS＆TEMED正常，并新鮮配制膠體。 B.空的泳道加Sample Buffer 解決： 避免膠體過熱。電壓過高也會出現微笑、歪斜條帶等條帶，建議上層濃縮膠使用80V；下層分離膠使用100-120V。另外也需檢查電泳槽是否有銹蝕造成電流不穩。過熱時可改為在冷室或者冰浴中進行電泳。 解決： 小心滾壓膠體并確保與膜貼合，有時出現 2個條帶是因為轉膜時不小心移動到膜產生疊影。 |
| ?高背景，怎么辦？?詳情信息 1、封閉問題 解決： A.確認封閉完-全。封閉作用不足，這是其中一種可能的原因，提高封閉物濃度可確保封閉液完-全覆蓋轉印膜，如使用5% 脫脂奶粉或BSA。 B.封閉液不與抗體反應。這種情況較常發生在磷酸化抗體的使用過程中，由于牛奶含有casein這種磷酸蛋白，因此如果使用牛奶當封閉液，封閉液與磷酸化抗體可能會產生非特異性的結合。這個情況下，建議使用BSA作為封閉液，同時搭配使用TBST的洗脫液來幫助降低高背景值的狀況。 C.封閉時間增加，一般情況會使用室溫37度封閉1小時，可視情況調整封閉的條件。 解決： A.選擇合適的膜（可參考詳情信息） B.膜干掉，建議整個實驗過程都須注意讓膜保持濕潤，特別是PVDF膜。 C.膜沒有完-全均勻濕透，PVDF膜較會出現這個狀況，使用PVDF膜前，需用100% methanol完-全浸潤膜。 解決： A.降低抗體濃度 B.以陽性對照確認二抗 C.足夠的洗脫時間和次數 解決： ECL呈色問題造成高背景值的原因，可能是因為化學顯色底物過多；建議按說明書加入適量的顯色底物。 |
| ?非特異性條帶，怎么辦？?詳情信息 1、蛋白降解 解決： A.加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解。 B.冰上操作。 C.避免反復凍融樣品（建議分裝）；建議使用新鮮制備的樣品。 2、蛋白形成多聚體 解決：A.使用現配的DTT/2-ME并將加熱時間延長，幫助打斷多聚體的雙硫鍵。 B.樣本煮沸溫度達到95℃-100℃。 解決： 查詢生物信息是否有后修飾、剪切體等。 解決： A.增加抗體稀釋倍數，也可調整孵育時間，并在4℃孵育。 B.減少上樣量。 解決： A.增加洗膜次數與時間或在洗滌液里改用不同強度的detergent或是增加濃度。 B.設對照組來確認抗體非專一性結合可能的原因，例如：是否有目標蛋白表達。 解決： 這種情況通常發生在IP實驗里，GeneTex有一系列可避免辨認heavy/light chain的特制二抗，其設計原理是用來辨認native的一抗結構。（可參考詳情信息） |
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