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ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗

來源:斯譜瑞(上海)生物科技有限公司   2024年03月19日 14:04  

酶聯(lián)免疫吸附試驗

(一) 原理是酶免疫技術(shù)中應(yīng)用*的一種。在合適的載體上,酶標記

抗體或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標記的抗原抗體免疫復合物,在一定的底物參與下

,復合物上的酶催化底物,使其水解、氧化或還原成另一種帶色物質(zhì)。由于在一定的條件下

,酶的降解底物和呈現(xiàn)色澤是成正比的,因此,可以應(yīng)用酶標測定儀進行測定,從而計算出

參與反應(yīng)的抗原和抗體的種類和含量。ELISA的技術(shù)類型很多,現(xiàn)僅將常用的幾種簡介如下

1 間接法主要用于檢測血清中的抗體,也可檢測抗原(圖341)。

341間接法原理示意圖

2 雙抗體夾心法用于檢測標本中大分子抗原(圖342)的一種方法。

342雙抗體夾心法原理示意圖


3 抗原競爭法此法也稱競爭性抑制法,主要用于測定小分子抗原(圖343)。其大致

步驟

如下:①使已知的抗體吸附于載體表面;②將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原溶

液以適當比例混合,加入已包被的載體孔中;③加入酶底物溶液,產(chǎn)生顏色反應(yīng)。色深表示

結(jié)合的酶標記抗原多,而待檢溶液中未標記的抗原量少;反之,色淺表示結(jié)合的酶標記抗

原少,而待檢溶液中抗原量多。

343抗原競爭法原理示意圖


此外還有直接法(檢測抗原)、雙夾心法(檢測抗原或抗體)、非標記抗體酶法(檢測抗原或抗

)等。

(二) 材料和方法(以檢測豬流行性腹瀉病毒抗體為例)

1 材料

(1) 聚苯乙烯塑料微量組織培養(yǎng)板:4×10孔,上海塑料三廠生產(chǎn)。

(2) 包被液(pH值96):NaHCO3 293g、Na2CO3 195g,蒸餾水加

1 000ml,置4℃保存。

(3) 洗滌液(001mol/L、pH值74PBS):NaCl 80g、KH2PO402g、N

a2HPO4·12 H2O 29g、KCl 02g、Tween20 05ml,加蒸餾水至1000ml。

(4) 保溫液:牛血清白蛋白(BSA) 01g、005% PBSTween20 100ml,4

℃保存。

(5) 底物溶液(OPDH2O2)

磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH值50):02mol/L Na2HPO4(284g/L)257ml、01mol/

L檸檬酸(192g/L)243ml、蒸餾水50ml。

底物溶液:磷酸鹽檸檬酸緩沖液100ml、鄰苯二胺(OPD)40mg、30%H2O2 015ml,現(xiàn)

配現(xiàn)用。

(6) 終止液(2mol/L H2SO4):濃硫酸222ml、蒸餾水1778ml。

(7) 豬流行性腹瀉(PED)抗原:PEDV豬胎腸原代細胞培養(yǎng)物,反復凍融,65℃

30min滅活。最后以3 000 r/min離心30min,取上清分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?乖牡?/span>

白濃度為300μg/ml。

(8) 酶標兔抗豬抗體結(jié)合物:按郭春祥方法制備。mol/L比為196,酶結(jié)合

物效價為1∶10 000。

(9) 被檢豬血清:采自疫區(qū)豬和病豬。PEDV免疫豬血清及健豬血清分別用于

陽性、陰性對照。

(10) 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測儀:南京華東電子管廠生產(chǎn)。


2 ELISA操作程序(間接法)

(1) 抗原包被:用包被液將PEDV抗原作1∶5稀釋包被反應(yīng)板,每孔100μl,

同時設(shè)陰性細胞培養(yǎng)物對照孔,置4℃過夜。

(2) 洗滌:用洗滌液洗滌2次,每次2min,瀝干。

(3) 加入被檢血清:用保溫液將被檢血清作1∶100稀釋,加入反應(yīng)板相鄰的

兩個孔中,每孔100μl。同時作陰、陽性標準血清對照,置37℃孵育1h。

(4) 洗滌3次:方法同上。

(5) 加入酶結(jié)合物:用保溫液將酶結(jié)合物作1∶4 000稀釋,加入反應(yīng)孔

中,每孔100μl,置37℃孵育1h。

(6) 洗滌3次:方法同上。

(7) 加入底物:每孔100μl,置室溫暗盒內(nèi)顯色20min。

(8) 加入終止液:每孔50μl,靜置5min。

(9) 測定OD值:用檢測儀,于492nm波長,按儀器使用及制定標準要求調(diào)節(jié)儀

器,測定各反應(yīng)孔的OD值,記錄結(jié)果。

(三)結(jié)果判定凡檢測血清P/N值超過14的,均判為陽性。肉眼觀察,凡

反應(yīng)孔的顏色比正常細胞對照孔、正常血清對照孔顏色深者為陽性。

(四) 注意事項

1 在各載體中使用最多的為聚苯乙烯塑料板。不同廠牌,甚至不同批號的反應(yīng)板吸附性能

往往有很大差異,因此使用前需要加以選擇。方法為:在整塊板上測定同一標本,求出每一

對孔的平均OD值,將此值與該板的總均值相比,其差值需在±10%以內(nèi)。

2 為了增加聚苯乙烯板對某些抗原或抗體的吸附作用,可試用鞣酸處理,牛血清白蛋白處

理,改變載體的表面電荷,引入化學基團等方法處理反應(yīng)板。

3 如非特異性吸附較強,需考慮采用封閉等方法排除。

(1) 封閉:可選用4%~10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%馬血清、01%

25%明膠等。

(2) 去污劑:可阻止非特異吸附,而不影響特異性抗原抗體反應(yīng)。常用的有0

05%~05%吐溫20、吐溫80、01%NP40等。

(3) 高鹽濃度緩沖液:如含05mol/L NaCl及005%吐溫的磷酸鹽緩沖液(pH

80)。

(4) 縮短孵育時間:保溫液中加入終濃度4%的聚乙二醇(PEG,MW6 000)

可縮短抗原抗體反應(yīng)的孵育時間(20min以內(nèi))。

4 由于反應(yīng)板可能存在邊緣效應(yīng),因此測定標本時至少要取兩孔的平均值。

5 各種常用的酶標反應(yīng)比色計性能不一,測定時需根據(jù)各自的儀器確定閾值。



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