哈嘍，最近發現很多小伙伴詢問活體轉染關于玻璃體注射的應用，今天小編就帶著幾篇相關應用文獻來給大家簡單介紹一下。

第一篇是來自中山大學中山眼科中心余克明教授與莊菁研究員團隊發表在Cell Death and Disease雜志上，題為”Lithium promotes DNA stability and survival of ischemic retinal neurocytes by upregulating DNA ligase IV”。

本文中，作者直接在缺血性大鼠視網膜中直接測試了鋰對DNA NHEJ（非同源末端連接）活性的影響。I/R（缺血再灌注） 手術后，如材料和方法中所述遞送NEHJ底物即線性化 pEGFP-N1。轉染后48 h，固定眼球，切片并檢查GFP表達。正如預期，RGC層顯示出最大的活性（圖1c），并且在I / R手術中，鋰顯著促進了DNA NHEJ活性（*P<0.05;圖1d）。有趣的是，即使沒有 I/R 手術，鋰也促進了 NHEJ，效率提高了 1.83 倍 （*P<0.05）。作者推測，觀察到這種效應是因為轉染對RGC層中的細胞造成輕度損傷。此外，在I/R手術組中，鋰促進了DNA NHEJ活性的2.4倍（**P<0.001）。即使沒有鋰預處理，I/R 手術也顯著增強了 NHEJ 事件 （**P<0.001）。 這些結果與先前的報道部分一致，即缺血刺激自發激活DNA修復，并且鋰在病理性缺血狀態下促進DNA修復

圖 1. (C).體內DNA NHEJ測定。（NHEJ修復測定的策略如圖3d所示。）I/R手術后24小時，按照制造商的說明，在轉染試劑（in-vivo jetPEI）后，用線性化質粒pEGFP-N1進行玻璃體內注射。在轉染后48小時，將視網膜固定并切片。在RGC層中可檢測到GFP。比例尺：100μmm (D).大鼠視網膜中GFP陽性細胞的比較。鋰預處理促進DNA NHEJ活性（假，0.67±0.62;假+鋰， 1.25±0.72; I/R 手術，5.5±1.19;I/R 手術+鋰，13.25±1.83）。n=8，每組，*P<0.05。**P<0.001。所有誤差線均代表 SEM

方法

配置質粒/in vivo jetPEI 復合物：EcoR1切割質粒pEGFP-N1后通過添加超純水調整濃度至4 μg/μl。根據生產商操作方法配置轉染復合物：將所需量的質粒和轉染試劑分別用10 μl 10%葡萄糖稀釋。每 μg線性化質粒pEGFP-N1添加0.05 μl in -vivo jetPEI。將質粒和轉染試劑混合并在室溫下孵育15min后形成轉染復合物即可注射。pcDNA3.1作為陰性對照。

玻璃體內注射：共32只重250-300g成年 Sprague–Dawley 大鼠用于玻璃體內注射。實驗分為2組（每組16只大鼠）：實驗組和對照組。實驗組每天皮下注射氯化鋰一次，從缺血前1周開始，到組織取樣當天結束，而對照組僅接受相同量的PBS。每日氯化鋰劑量1.0mEq/kg。每組分為兩個亞組（每個亞組8只大鼠）：取一個亞組進行I/R實驗，另個亞組不進行I/R作為對照。I/R手術后24小時，對所有大鼠的右眼進行玻璃體內注射。每次注射2.5 μl 轉染復合物，使用Hamilton注射器在無菌條件下進行玻璃體內注射。

第二篇是最近發表在Communications Biology上題為“Vascular cell-adhesion molecule 1 (VCAM-1) regulates JunB-mediated IL-8/CXCL1 expression and pathological neovascularization”血管細胞粘附分子1（VCAM-1）調節 JunB 介導的 IL-8/CXCL1 表達和病理性新生血管形成

VCAM-1敲除小鼠由于胎盤發育缺陷導致胚胎致死，所以這里作者使用玻璃體內注射 VCAM-1 siRNA 來評估 VCAM-1 缺失對 OIR（氧誘導視網膜病變）誘導的小鼠病理性視網膜血管生成的重要性。我們在 P12 和 P14 時進行玻璃體內注射 0.5 μl 含有in- vivo jetPEI® 轉染試劑和 1 μg 對照或 VCAM-1 siRNA 的 5% 葡萄糖溶液。在P15時，對眼睛進行眼球摘除，分離視網膜，并制備視網膜提取物，并分析常氧和缺氧視網膜中的CXCL1、JunB和VCAM-1水平。與對照 siRNA 組相比，注射 VCAM-1 siRNA 的小鼠缺氧誘導的 CXCL1、JunB 和 VCAM-1 表達減弱（圖 2a）。在 P17 時，視網膜也用異凝集素 B4 染色，平放，并量化新生血管形成或缺血面積的百分比。VCAM-1水平減弱的缺氧誘導的視網膜新生血管形成（圖2b和c）和視網膜內皮細胞（EC）尖duan細胞形成（圖2e）的下調。在對照組或VCAM-1 siRNA組的缺血面積方面未觀察到顯著差異（圖2d）。這些觀察結果表明，VCAM-1 在 OIR 小鼠模型中調節 JunB-CXCL1 信號傳導和病理性視網膜新生血管形成。

圖2. 將 C57BL/6 小鼠幼崽暴露于 75% 氧氣 （P7-P12） 中，返回室內空氣中，并在玻璃體內注射 0.5 μl 的5% 葡萄糖溶液 包含in vivo jetPEI®的 和 1 μg 對照或 在P12 和 P14 的 VCAM-1 siRNA。在 P15 時，眼球摘除，分離視網膜，制備組織提取物并分析 ，通過蛋白質印跡法檢測 CXCL1 和JunB水平，并在印跡中重新檢測 VCAM-1 和 β-tubulin，用來顯示 siRNA 對其靶標和脫靶分子的影響。b、d、e 一切都與圖 （a） 相同，除了在 P17 時，眼睛被摘除，視網膜分離，用異凝集素 B4 染色，準備平坦支架并檢查視網膜新生血管形成 （b）、缺血區 （d） 和內皮jian端細胞形成 （e）。面板 b 中的中間列顯示所選區域的較高放大倍率。新生血管在圖（b）的第三列中以紅色突出顯示。c、d 條形圖表示新生血管形成 （c） 和缺血面積 （d） 的定量分析。n = 每組 8 只 （c， d） 每組為生物學獨立的眼睛，用平均值表示± SD。 *P < 0.05 與 siControl。在面板 （b） 左列和右列中 比例尺代表500 μm，面板 （b） 中列代表20 μm，面板 （d）中代表 500 μm，面板 （e） 上行代表 20 μm，面板 （e） 下行代表 50 μm。

方法：

小鼠在12小時光照/12小時黑暗循環環境中飼養和繁殖，并隨意喂食水和食物。在出生后第7天（P7），在BioSpherix室中將有母鼠的小鼠幼崽暴露于75%的氧氣（高氧）5天（P7-P12），在P12時，幼鼠和母鼠一起返回室內空氣。對于對照組，將同齡小鼠幼崽保持在21%氧氣（即室內空氣）下。在 P12 和 P14 時，in- vivo jetPEI和1ug siRNA混合在終濃度為5%葡萄糖溶液中形成轉染復合物，使用35?G針對小鼠幼崽玻璃體注射劑量為0.5uL轉染復合物。

相關文獻

[1] Yang, Ying , et al. "Lithium promotes DNA stability and survival of ischemic retinal neurocytes by upregulating DNA ligase IV." Cell Death & Disease 7.11(2016):e2473.

[2] Kaur, Geetika , et al. "Vascular cell-adhesion molecule 1 (VCAM-1) regulates JunB-mediated IL-8/CXCL1 expression and pathological neovascularization." Communications Biology 6(2023).

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