準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。

分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、0孔和樣本孔，計(jì)算好當(dāng)次試驗(yàn)所需要的板條數(shù)量，將不需要的板條拆卸下來，用新的封板膜重新封好，放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 μL的2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。0孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液。

加樣本：樣本孔加入50 μL的待測樣本。

加生物素化檢測抗體：立即每孔加入50 μL生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中。保證步驟3、4、5連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在10 min內(nèi)完成。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育45 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌3次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

加酶結(jié)合物：加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須移除干凈殘留液體。

加底物顯色：每孔加入90 μL顯色底物TMB，避光，37℃避光顯色15 min。

加終止液：每孔加入50 μL終止液，終止液加入的順序應(yīng)盡量與顯色底物加入的順序相同。

檢測讀數(shù)：在5 min之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和630 nm參考波長下的OD值。