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細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而細(xì)胞凍存步驟及細(xì)胞凍存液的選擇也是影響細(xì)胞凍存效率及解凍復(fù)蘇后細(xì)胞活力的主要條件。
下面就以細(xì)胞凍存液為例講解細(xì)胞凍存原理及細(xì)胞凍存的步驟。
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
細(xì)胞凍存方法主要操作步驟為：
(1)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天最好換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收 集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。
(2)去上清液，加入含20%小牛血清的培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無(wú)菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為3×106～1×107/mL 之間。
(3)將上述細(xì)胞分裝于安瓿或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤校碴逞b1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要封閉，圓滑無(wú)勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記 好細(xì)胞名稱(chēng)和凍存日期，同時(shí)作好登記(日期、細(xì)胞種類(lèi)及代次、凍存支數(shù))。
(4)將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中 2～3小時(shí)，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時(shí)(此步可省略)，再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時(shí)，最后沉入液氮中。
細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見(jiàn)，凍存半年后，最好取出一只安瓿細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。
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