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細(xì)胞凍存液分類(lèi)與選擇

來(lái)源:和元李記(上海)生物技術(shù)有限公司   2022年04月24日 12:32  

  細(xì)胞凍存是細(xì)胞生物學(xué)研究及藥物研發(fā)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中需要經(jīng)常面對(duì)的常規(guī)操作。隨著細(xì)胞越來(lái)越嬌,人工越來(lái)越貴,各種細(xì)胞凍存液應(yīng)運(yùn)而生,如何從名目繁多的細(xì)胞凍存液中選擇變成一個(gè)問(wèn)題。本文從細(xì)胞凍存液分類(lèi),應(yīng)用場(chǎng)景,使用效果等多方面加以闡釋?zhuān)M軐?duì)如何選擇細(xì)胞凍存液有所助益。

一、細(xì)胞凍存液的分類(lèi)

  1. 從成分劃分

(1)滲透性和非滲透性

  滲透性保護(hù)劑分子量小可滲透到細(xì)胞內(nèi),如甘油、DMSO、乙二醇等,其在細(xì)胞冷凍存*凝固之前,滲入細(xì)胞內(nèi),降低細(xì)胞內(nèi)外溶液中的電解質(zhì)濃度,阻止細(xì)胞內(nèi)水分外滲,避免細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮,避免細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境冰晶的生成。
  非滲透性保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi),多為大分子物質(zhì),如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白及羥、yi、ji淀粉(HES)等。這些大分子優(yōu)先同溶液中的水分子結(jié)合,降低了細(xì)胞外自由水的含量,使冰點(diǎn)降低,減少冰晶形成;同時(shí),由于分子量大,使溶液中電解質(zhì)濃度降低,減輕了溶質(zhì)損傷。

  DMSO是一類(lèi)滲透性細(xì)胞凍存保護(hù)試劑的代表,這類(lèi)試劑包括:甘油、DMSO、乙烯醇和乙酰胺等。從上述幾種物質(zhì)滲透進(jìn)出細(xì)胞的速度及細(xì)胞凍存效果看,DMSO效果更好,所以常規(guī)的細(xì)胞凍存液大都含有DMSO。DMSO在細(xì)胞凍存中保護(hù)細(xì)胞的原理是快速降低細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)濃度、減少降溫通過(guò)冰點(diǎn)時(shí)冰晶產(chǎn)生進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受傷害。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基、血清和DMSO按照一定的比例混合,其中DMSO的含量是10%。

(2)是否含血清

  細(xì)胞凍存液含血清是從細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境角度考慮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù),但含血清(屬動(dòng)物源成分)勢(shì)必需要考慮細(xì)胞污染、批間穩(wěn)定性等因素,另外隨著細(xì)胞治療研究逐漸成為熱點(diǎn),研究及生產(chǎn)過(guò)程的可預(yù)知、可控制要求,胎牛血清的使用液受到限制。包括李記生物在內(nèi)的多家公司陸續(xù)開(kāi)發(fā)成功不含血清的細(xì)胞凍存液,不含血清及動(dòng)物來(lái)源性蛋白,減少病毒、霉菌和支原體等的污染。含血清的細(xì)胞凍存液一般采用程序降溫(4℃→-20℃→-80℃→液氮),原因是血清中含有大量蛋白、細(xì)胞因子,血清含量較大的凍存細(xì)胞凍存液在溫度快速降低時(shí),會(huì)造成有較多蛋白沉淀。

(3)是否含DMSO

  作為滲透性細(xì)胞保護(hù)劑的代表,DMSO應(yīng)用非常廣泛,DMSO可以快速滲透進(jìn)入細(xì)胞,是非程序性降溫的基礎(chǔ)。但是DMSO在低溫下能保護(hù)細(xì)胞,但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害,研究結(jié)果表明,培養(yǎng)液中DMSO濃度為10 %時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率近100 %;1%濃度時(shí)抑制率為35%,即使是0.04 %的濃度,DMSO對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也有不利的影響。正是因?yàn)槿绱耍?xì)胞復(fù)蘇后需要離心去除DMSO。在一些臨床研究中,如果在細(xì)胞凍存中用到了DMSO,則需要說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞的毒副作用是否對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響,也需要說(shuō)明DMSO殘留的問(wèn)題。DMSO替代物的開(kāi)發(fā)也是從滲透與非滲透兩個(gè)方向研究,目前來(lái)看,滲透性的小分子化合物更具前景。李記生物從2015年開(kāi)啟不含血清,不含DMSO的細(xì)胞凍存液產(chǎn)品的研發(fā);第一代低DMSO得GMP級(jí)別凍存液已于2022年上市,詳情可關(guān)注李記生物微信公眾號(hào)文章-搜索“凍存液”。

  1. 從操作過(guò)程劃分

  是否需要程序降溫是細(xì)胞凍存中需要考慮的另一個(gè)因素。常規(guī)細(xì)胞凍存液采用培養(yǎng)基+血清+DMSO配置,一般需要采用程序降溫凍存細(xì)胞(先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘,然后移至-20℃冰箱30分鐘,再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)(或隔夜),最后才移至液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期的儲(chǔ)存)。目前包括李記生物已經(jīng)有多款新型細(xì)胞凍存液上市,不需要程序降溫,一步深凍,無(wú)需照看,節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

二、細(xì)胞凍存液選擇

  細(xì)胞凍存液的選擇須遵循幾個(gè)原則:①細(xì)胞在凍存和溶解過(guò)程中的損傷減低到最小,細(xì)胞存活率高;②凍存細(xì)胞復(fù)溫后,其的細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)明顯影響;③細(xì)胞復(fù)溫后,低溫保護(hù)劑容易去除,成分清楚,對(duì)細(xì)胞、人體無(wú)毒副作用;④凍存保護(hù)劑可快速起效,減少操作步驟;⑤價(jià)格。

三、注意事項(xiàng)

  1. 常規(guī)細(xì)胞凍存液配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)與DMSO按9:1配制。DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí),DMSO加入培養(yǎng)基將釋放大量熱量,所以細(xì)胞凍存液需提前配制,避免燙傷細(xì)胞。注意,不能直接在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加DMSO。

  2. 選擇不含DMSO的細(xì)胞凍存液時(shí),需確認(rèn)替代成分的物質(zhì)基礎(chǔ),如果替代成分較DMSO潛在危害更大,則得不償失。

  3. 選用不含DMSO的細(xì)胞凍存液,需確認(rèn)無(wú)細(xì)菌及細(xì)胞污染,要進(jìn)行支原體檢測(cè)。


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